ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼの基質認識と反応の機構

线粒体加工肽酶的底物识别和反应机制

基本信息

批准号：
08278222
负责人：
伊藤明夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断位置よりC末端側も関与していることが分かった。2.これまで合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸の重要性が示唆されていたが、前駆体全体を用いても同様の要求性があることを確認した。3.2つのサブユニットのcDNAの特定部位あるいはランダムに変異を与え、アドレノドキシン前駆体との共発現系を用いて変異酵素のスクリーニングを行った。変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、酵素の活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群、等の同定を行った。4.酵母の2つのサブユニットのクローニングを行った。酵母とほ乳動物のサブユニットを大腸菌で発現させ、両者の安定なハイブリド酵素を作ることにより、これまで不安定で精製が困難であった酵素の精製を可能にした。

目的是阐明前体识别的机理以及加工肽酶的成分亚基的作用，这些肽酶的裂解和去除（过程）被转运至线粒体的前体蛋白的扩展肽，并将其变成成熟的形式。今年，我们分析了以下两个点：（1）该酶特异性识别为底物的前体延伸肽的基本结构，足以裂解特定位置，以及（2）搜索该酶的每个两个亚基的作用，以及氨基酸在氨基酸中均涉及氨基酸以及伴有抗氨基酸在底酸盐中结合和活性表达。 1。使用牛酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶作为实例，已系统地转化氨基酸的肽是化学合成的，并且使用这些肽的亲和力与肽酶的亲和力以及与裂解的速率（水解）的速率相关，并且与c-tressimals in distriental at clea sandiinals IS进行了分析。基材。 2.先前，使用合成肽的分析表明，精氨酸和远端碱性氨基酸的重要性与裂解点接近，以及位置1处的疏水氨基酸，但即使使用整个前体，也可以证实，即使使用整个前体也有相似的需求。 3。在特定位点或在两个亚基的cDNA中随机进行突变，并使用具有肾上腺素毒素前体的共表达系统筛选突变的酶。分析了突变酶的底物识别和裂解反应，并鉴定了鉴定酶的活性中心金属的结合氨基酸，并鉴定了被认为与底物结合有关的酸性氨基酸。 4。克隆两个酵母亚基。通过在大肠杆菌中表达酵母和哺乳动物亚基并在它们之间产生稳定的杂化酶，可以净化以前不稳定且难以纯化的酶。