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ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼの基質認識と反応の機構

线粒体加工肽酶的底物识别和反应机制

基本信息

批准号：
08278222
负责人：
伊藤明夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断位置よりC末端側も関与していることが分かった。2.これまで合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸の重要性が示唆されていたが、前駆体全体を用いても同様の要求性があることを確認した。3.2つのサブユニットのcDNAの特定部位あるいはランダムに変異を与え、アドレノドキシン前駆体との共発現系を用いて変異酵素のスクリーニングを行った。変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、酵素の活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群、等の同定を行った。4.酵母の2つのサブユニットのクローニングを行った。酵母とほ乳動物のサブユニットを大腸菌で発現させ、両者の安定なハイブリド酵素を作ることにより、これまで不安定で精製が困難であった酵素の精製を可能にした。

The length of the body protein of the ミトコンドリアににtransportationされたpre-bulk body protein is cut and removed (プロセシング)し, the mature body にするプロセシングペプチダーゼの前槆physical recognition のorganization と constitute サブユニットのservice cut を Explain することをtarget としている. This year's 2 o'clock analysis is done. (1) This enzyme has a specific base, a specific recognition, a specific position, a cut, and a lengthening of the front body that is necessary. The basic structure of this enzyme, (2) the enzyme is divided into two parts, each one is divided into two parts, the substrate is bound to the active substance, and the active substance is present. 1. Rino acid dehydrase enzyme およびアスパラギン acid アミノトランスフェラーゼの extension Examples of ペプチドを, system of にアミノ acid を変 in exchange for したペプチドを chemical synthesis し, これらをいてペプチダーゼとの Affinity や Cut off (hydrolysis) Reaction speed を Quantitative に Analysis し、 Matrix とてRequires される structure として, cutting position よりC end side も关 and していることが分かった. 2. Use the これまで synthetic ペプチドを to use the いた analysis により, the cutting point より near position のアルギニンおよび far position の塩 basic アミノ acid, およThe importance of the 1st position of the aqueous acid is indicated, and the entire front body is confirmed with the required properties. 3.2 Specific parts of cDNA in the specific parts of the cDNA The ドレノドキシン前槆体との公発出款 is now using the いて変isozyme のスクリーニングを行った. The recognition of substrate of isozyme and the analysis of cutting back reaction, the active center metal of enzyme and the binding of アミノ acid, the substrate binding and the acidic アミノ acid group, etc. 4. Yeast の2つサブユニットのクローニングを行った. Yeast and milk animal enzymes It's easy to make, it's not stable, it's difficult to refine, it's difficult to make enzymes, it's possible to make enzymes, it's possible.