ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子機構

线粒体前体加工的分子机制

基本信息

批准号：
09267224
负责人：
伊藤明夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去法(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換した合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸が基質として必要な構造であることを提唱してきたが、それらのみを持つペプチドでは切断が見られず、他の必要構造の存在が示唆されていた。今回の解析により、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸(2位はセリン、トレオニン、ヒスチジンなど、3位はトレオニン、セリンなど)も重要な役割を果たしていることを確認した。2.蛍光プローブを付加したペプチド基質を用いて、酵素タンパク質への結合反応を解析した。酵素へは切断反応のKmとほぼ同様の10^<-7>オーダーの解離定数で結合したが、2つのサブユニット単独には30-50倍の解離定数を示した。また、結合したペプチドによる蛍光の消光実験より、基質が酵素の表面ではなく少し奥に結合していることが示され、両サブユニットが協同して基質結合部位を形成していることが示唆された。3.2つのサブユニットについての精製変異酵素を用いた解析により、活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われるグルタミン酸、等の同定を行い、基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットが関与していることが示唆された。

目的是切割和去除（过程）（过程）将前体蛋白的扩展肽转运到线粒体，并阐明前体识别的机制以及加工肽酶的组成亚基的作用，这些肽酶变成成熟形式。今年，我们分析了以下两个点：（1）该酶特异性识别为底物的前体延伸肽的基本结构，足以裂解特定位置，以及（2）搜索该酶的每个两个亚基的作用，以及氨基酸在氨基酸中均涉及氨基酸以及伴有抗氨基酸在底酸盐中结合和活性表达。 1. Analysis using extended peptides of malate dehydrogenase and aspartate aminotransferase as examples, using synthetic peptides that have systematically converted amino acids, has proposed that arginine and distal basic amino acids proximal to the cleavage point and hydrophobic amino acids at position 1 are the required structures as substrates, but peptides containing only these did not show cleavage, suggesting存在其他必要的结构。该分析证实，裂解位置的C末端位置2和3处的氨基酸（丝氨酸，苏氨酸，组氨酸等处于位置2；苏氨酸，丝氨酸等位置3）也起着重要作用。 2。使用添加荧光探针的肽底物分析与酶蛋白的结合反应。该酶与10^<-7>阶的解离常数结合，该阶段与裂解反应的Km几乎相同，但是仅两个亚基的解离常数为30-50次。此外，使用结合肽进行荧光的淬火实验表明，底物的结合比酶的表面略深，这表明两个亚基合作以形成底物结合位点。 3。使用纯化的突变酶对两个亚基进行分析，鉴定出活性中心金属的结合氨基酸，被认为与底物结合有关的谷氨酸，并提出β-和α-亚基在底物的近乎降低点中涉及底物的近切位，而不是氨基末端。