ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子機構

ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去法(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換した合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸が基質として必要な構造であることを提唱してきたが、それらのみを持つペプチドでは切断が見られず、他の必要構造の存在が示唆されていた。今回の解析により、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸(2位はセリン、トレオニン、ヒスチジンなど、3位はトレオニン、セリンなど)も重要な役割を果たしていることを確認した。2.蛍光プローブを付加したペプチド基質を用いて、酵素タンパク質への結合反応を解析した。酵素へは切断反応のKmとほぼ同様の10^<-7>オーダーの解離定数で結合したが、2つのサブユニット単独には30-50倍の解離定数を示した。また、結合したペプチドによる蛍光の消光実験より、基質が酵素の表面ではなく少し奥に結合していることが示され、両サブユニットが協同して基質結合部位を形成していることが示唆された。3.2つのサブユニットについての精製変異酵素を用いた解析により、活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われるグルタミン酸、等の同定を行い、基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットが関与していることが示唆された。

ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去法(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換した合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸が基質として必要な構造であることを提唱してきたが、それらのみを持つペプチドでは切断が見られず、他の必要構造の存在が示唆されていた。今回の解析により、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸(2位はセリン、トレオニン、ヒスチジンなど、3位はトレオニン、セリンなど)も重要な役割を果たしていることを確認した。2.蛍光プローブを付加したペプチド基質を用いて、酵素タンパク質への結合反応を解析した。酵素へは切断反応のKmとほぼ同様の10^<-7>オーダーの解離定数で結合したが、2つのサブユニット単独には30-50倍の解離定数を示した。また、結合したペプチドによる蛍光の消光実験より、基質が酵素の表面ではなく少し奥に結合していることが示され、両サブユニットが協同して基質結合部位を形成していることが示唆された。3.2つのサブユニットについての精製変異酵素を用いた解析により、活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われるグルタミン酸、等の同定を行い、基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットが関与していることが示唆された。