ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子機構

线粒体前体加工的分子机制

基本信息

批准号：
10163227
负责人：
伊藤明夫
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

寄生原核生物に由来し、進化的に関連あるオルガネラのプロセシングにおける前駆体とベプチダーゼとの特異的分子認識や切断位置決定に関与する双方の構造要素とそれらの相互作用、活性部位の構造、反応機構を理解することを目標としている。本年度は、ミトコンドリアとヒドロゲノソームに焦点を合わせ、ミトコンドリアに関してはプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構を前駆体と酵素の両側から解析した。一方、ヒドロゲノソームに関しては酵素本体のcDNAクローニングを試みた。1. いくつかの前駆体タンパク質の延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸以外に、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸も重要な役割を果していることを確認した。2. 蛍光標識ペプチド基質と精製酵素との相互作用の解析から、高親和性の基質結合には2つのサブユニットの複合体形成が必須であり、複合体中の奥まったところに結合する。サブユニット単独でも親和性は低いが結合し、それぞれ、基質中の近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸に対する特異性が見られた。3. 変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群の同定を行った。基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットの酸性アミノ酸が関与していることが示唆された。4. 2つのサブユニットのそれぞれについて、生物種間でホモロジーの高い部分をPCRプライマーとしてTrichomonasおよびTripanosomaのcDNAあるいは遺伝子ライブラリーからプロセシングプロテアーゼホモローグのcDNAクローニングを試みた。後者からβ-サブユニットの相当する部分cDNAが得られた。

目的是了解寄生原核生物和进化相关的细胞器及其活性位点的相互作用，活性位点的相互作用及其反应机制的过程中，前体和veptidass涉及特定分子识别和裂解定位的结构元素。今年，我们专注于线粒体和氢化体，对于线粒体，从前体和酶的两侧分析了前体识别加工肽酶的机制。另一方面，酶本身的cDNA克隆尝试用于氢化体。 1。使用几种前体蛋白的扩展肽作为实例，已化学合成了已经进行系统转化的氨基酸的肽，并使用这些肽与肽酶的亲和力（水解速率（水解）的速率（水解）反应进行了定量分析，并需要进行近距离的基本酸性氨基酸性，并将其作为跨度氨基酸剂量的序列化。位置1的氨基酸，裂解位置的C末端位置2和3处的氨基酸起着重要作用。 2。分析荧光标记的肽底物和纯化酶之间的相互作用表明，两个亚基的复合形成对于高亲和力底物结合至关重要，并且与复合物中更深的位置结合。单独的亚基也具有低亲和力，但具有结合，并且分别对基板的近端精氨酸和远端碱性氨基酸具有特异性。 3。分析突变酶的底物识别和切割反应，并鉴定出鉴定出与底物结合有关的酸性氨基酸。有人提出，α-亚基的酸性氨基酸涉及底物的裂解点附近，并且β-亚基比氨基末端更多。 4。对于两个亚基中的每一个，我们尝试使用物种作为PCR引物的物种之间的高度同源部分来从Trichomonas和Tripanosoma和Tripanosoma的cDNA cDNA克隆。从后者那里获得了β-亚基的相应部分cDNA。