NMRとX線小角散乱によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

利用NMR和小角X射线散射分析黑曲霉酸性蛋白酶A的折叠机制

• 批准号: 07280203
• 负责人: 田之倉 優
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280203/
• 关键词: 酸性プロテアーゼ; クロコウジカビ; 非ペプシン型酸性プロテアーゼ; NMR; 核磁気共鳴法; X線小角散乱; Kratky plot

クロコウジカビA.nigerが分泌する酸性プロテアーゼAは、基質特異性、阻害剤に対する反応性等の性質が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる。intact酵素の分子量は22,000で、軽鎖(39残基)と重鎖(173残基)の2本鎖が非共有結合的に結合している。プロテアーゼAは酸性では安定であるが、中性以上のpHで不可逆的に変性し軽鎖と重鎖が解離する。本研究では、プロテアーゼAの水溶液中の構造、中性変性中間状態ならびに変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにするためにNMRスペクトルとX線小角散乱の測定を行った。本酵素のpH変性について種々の方法を用いて、詳細な解析を行った結果、変性の中点pHはNMRで6.6,CDで6.1、HPLCで6.0とNMRがCDやHPLCに比べて約0.4高かった。NMRとCDによる変性中点pHの差については、変性中間体の存在が現在唯一の整合的な解釈であるが、その構造的特徴も側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れている、というモルテングロビュールとは逆の性状を有している。動的構造を解析するために^<13>C,^<15>Nラベル蛋白質を調製し、多核3次元NMRスペクトルを測定して解析を行っている。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果Kratky plotから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded stateである、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態である、ことが分かった。pH6.2のKratky plotは、モルテングロビュール状態の特徴と似てはいるが、本蛋白質の場合この特徴は、側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れているために生じたと考えられる。

A. niger secretes acidic enzymes that differ in their properties, such as substrate specificity and toxicity. The molecular weight of the intact enzyme is 22,000 residues, and the two main locks (39 residues) and the double lock (173 residues) are combined in a non-consensus manner. The pH value of the acid solution is higher than that of the neutral solution. This paper studies the structure, neutral state and chemical process in aqueous solution. The pH of the enzyme was determined by the method. Detailed analysis was carried out. The results showed that the pH of the enzyme was 6.6, CD was 6.1, HPLC was 6.0, and CD was 0.4 higher than HPLC. NMR and CD are different in pH value, and the existence of different intermediates is now unique in the integration of solutions, structural characteristics, side locks, tertiary structures, natural state, protection of main locks, secondary structures, and reverse properties. Dynamic structure analysis, protein modulation, multi-nuclear 3D NMR analysis<13><15>The pH value of the acid, weak acid and weak acid species was measured by X-ray small angle scattering. The results of Kratky plot,(1) pH4.5 folded structure, pH6.75 unfolded state,(2) pH6.2 completely folded state unfolded state middle state,. The Kratky plot of pH6.2 is characterized by a three-order structure of the protein, a two-order structure of the protein, and a two-order structure of the protein.

项目成果

Fukada,H.: "Differential scanning calorimetric studies of the thermal unfolding of acid proteinase A from Aspergillus niger at various pHs." Thermochim.Acta. 267. 373-378 (1995)

Fukada, H.：“不同 pH 值下黑曲霉酸性蛋白酶 A 热解折叠的差示扫描量热研究。”

Kojima,M.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)

小岛 M.：“天冬氨酸蛋白酶：结构、功能、生物学和生物医学意义（高桥 K. 编辑）” Plenum，5 (1995)

Hatano,K.: "Primary structure,sequence-specific ^1H NMR assignments and secondary structure in solution of bromelain inhibitor VI from pineapple stem." Eur.J.Biochem.232. 335-343 (1995)

Hatano,K.：“来自菠萝茎的菠萝蛋白酶抑制剂 VI 溶液中的一级结构、序列特异性 ^1H NMR 归属和二级结构。”

Suzuki,R.: "Relationship between thermodynamic stability and molecular structure of Lys25-ribonuclease T_1." Bioimages. 3. 65-69 (1995)

Suzuki,R.：“Lys25-核糖核酸酶 T_1 的热力学稳定性与分子结构之间的关系。”

Sasaki,H.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)

Sasaki, H.：“天冬氨酸蛋白酶：结构、功能、生物学和生物医学意义（Takahashi, K.，编辑）” Plenum，5 (1995)