NMRとX線小角散乱によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

クロコウジカビA.nigerが分泌する酸性プロテアーゼAは、基質特異性、阻害剤に対する反応性等の性質が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる。intact酵素の分子量は22,000で、軽鎖(39残基)と重鎖(173残基)の2本鎖が非共有結合的に結合している。プロテアーゼAは酸性では安定であるが、中性以上のpHで不可逆的に変性し軽鎖と重鎖が解離する。本研究では、プロテアーゼAの水溶液中の構造、中性変性中間状態ならびに変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにするためにNMRスペクトルとX線小角散乱の測定を行った。本酵素のpH変性について種々の方法を用いて、詳細な解析を行った結果、変性の中点pHはNMRで6.6,CDで6.1、HPLCで6.0とNMRがCDやHPLCに比べて約0.4高かった。NMRとCDによる変性中点pHの差については、変性中間体の存在が現在唯一の整合的な解釈であるが、その構造的特徴も側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れている、というモルテングロビュールとは逆の性状を有している。動的構造を解析するために^<13>C,^<15>Nラベル蛋白質を調製し、多核3次元NMRスペクトルを測定して解析を行っている。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果Kratky plotから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded stateである、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態である、ことが分かった。pH6.2のKratky plotは、モルテングロビュール状態の特徴と似てはいるが、本蛋白質の場合この特徴は、側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れているために生じたと考えられる。

クロコウジカビA.nigerが分泌する酸性プロテアーゼAは、基質特異性、阻害剤に対する反応性等の性質が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる。intact酵素の分子量は22,000で、軽鎖(39残基)と重鎖(173残基)の2本鎖が非共有結合的に結合している。プロテアーゼAは酸性では安定であるが、中性以上のpHで不可逆的に変性し軽鎖と重鎖が解離する。本研究では、プロテアーゼAの水溶液中の構造、中性変性中間状態ならびに変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにするためにNMRスペクトルとX線小角散乱の測定を行った。本酵素のpH変性について種々の方法を用いて、詳細な解析を行った結果、変性の中点pHはNMRで6.6,CDで6.1、HPLCで6.0とNMRがCDやHPLCに比べて約0.4高かった。NMRとCDによる変性中点pHの差については、変性中間体の存在が現在唯一の整合的な解釈であるが、その構造的特徴も側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れている、というモルテングロビュールとは逆の性状を有している。動的構造を解析するために^<13>C,^<15>Nラベル蛋白質を調製し、多核3次元NMRスペクトルを測定して解析を行っている。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果Kratky plotから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded stateである、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態である、ことが分かった。pH6.2のKratky plotは、モルテングロビュール状態の特徴と似てはいるが、本蛋白質の場合この特徴は、側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れているために生じたと考えられる。