内分泌攪乱物質代謝能を有する微生物の創製

创造能够代谢内分泌干扰物的微生物

• 批准号: 14042231
• 负责人: 榊 利之
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14042231/
• 关键词: ダイオキシン; シトクロムP450; 部位特異的変異導入; 環境浄化; 内分泌攪乱物質; TCDD; 内分泌撹乱物質

今年度は以下の3項目を検討した。(i)CYP1A1変異体の解析24種のラットCYP1A1変異体を作製し、ダイオキシン類に対する活性を測定したところ、4種の変異体F228A,F240A,F319A,F385Aにおいて、2,3,7,8-TCDDに対する活性を検出することができた。次に、6種の二重変異体、F228A/F240A、F228A/F319A、F228A/F385A、F240A/F319A、F240A/F385A、F319A/F385Aを作製し、2,3,7,8-TCDDに対する活性を調べた。F228A/F319A以外の二重変異体はいずれも酵母における発現量が著しく低下し、またへいずれの変異体においても活性は元の変異体よりも低下していた。二重変異体における発現量の低下はフェニルアラニンからアラニンへの変異による構造の不安定化によると考えられる。(ii)酵母内で発現したヒト由来UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)によるダイオキシンの代謝酵母内で発現させたヒト由来UGT1 A1,1A9,および2B7を用いて8-OH-2,3,7-TriCDDに対するグルクロン酸抱合活性を調べたところ、UGT1A1および1A9において活性が見られ、昆虫細胞-バキュロウイルス発現系での結果と一致した。UGT2B7については活性が認められなかったが、発現量がきわめて低いためと考えられる。本研究では宿主としてS.cerevisiaeを用いたが、メタノール資化性酵母あるいは担子菌きのこ等での発現も可能であると考えられる。(iii)放射菌由来CYP105A1の大腸菌内発現、精製およびダイオキシン結合能基質結合差スペクトルから、放線菌由来CYP105A1が2,3,7,8-TCDDを結合することを見出した。2,3,7,8-TCDDに対する活性は認められないものの、基質ポケットに2,3,7,8-TCDDが結合し、第6配位子の水分子が追い出されるという状況は(i)におけるラットCYP1A1と同じである。したがって、CYP1A1の場合と同様、最小限のアミノ酸置換により、ダイオキシン分解酵素が作製できる可能性がある。X線結晶構造解析により立体構造を解明し、ダイオキシン分解酵素を精密にデザインするため、CYP105A1の結晶化を試みている。

This year, the following three projects were discussed. (i) Analysis of CYP1A1 isoforms 24 species of CYP1A1 isoforms were tested for their activity against 2,3,7,8-TCDD and 4 species of CYP1A1 isoforms F228A, F240A, F319A, F385A. In addition, 6 kinds of double heterozygotes, F228A/F240A, F228A/F319A, F228A/F385A, F240A/F319A, F319A/F385A, F240A/F385A, F319A/F385A, F240A/F385A, F319A/F385A, F319A/F385A, F240A/F240A F28A/F319A double heterozygote with low yeast activity Double heteromorphic structure, low occurrence, structural instability, structural (ii)The enzyme activity in yeast was modulated by 8-OH-2,3,7-TriCDD and UGT1 A1, 1A9, and 2B7, respectively. The enzyme activity in insect cells was consistent with that in yeast. UGT2B7 In this study, the host S. cerevisae was used as a medium to develop yeast. (iii)It has been revealed that actinobacteria are found in Escherichia coli derived from CYP105A1, that refined actinobacteria bind to the substrate with the binding energy of DNAKISHEN, and that actinobacteria bind to 2,3,7,8-TCDD derived from CYP105A1. 2,3,7,8-TCDD is associated with water molecules of the 6th ligand and is present in the presence of CYP1A1. In the case of CYP1A1, the possibility of minimal acid substitution and enzyme degradation is discussed. X-ray crystal structure analysis, three-dimensional structure analysis, enzyme decomposition, precise crystallization of CYP 105A1

项目成果

Sakaki, T., Shinkyo, R., Takita, T., Ohta M., Inouye, K.: "Biodegradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) by recombinant yeast producing rat CYP1A subfamily"Arch. Biophys. Biochem.. 401. 91-98 (2002)

Sakaki, T.、Shinkyo, R.、Takita, T.、Ohta M.、Inouye, K.：“通过生产大鼠 CYP1A 亚家族的重组酵母对多氯二苯并-对-二恶英 (PCDD) 进行生物降解”Arch。

Shinkyo, R., Sakaki, T., Ohta, M., Inouye, K.: "Metabolic Pathways of dioxins by CYP1A1 : species difference between rat and human CYP1A subufamily in the metabolism of dioxins"Arch. Biochem. Biophys.. 409. 180-187 (2003)

Shinkyo，R.，Sakaki，T.，Ohta，M.，Inouye，K.：“CYP1A1 的二恶英代谢途径：大鼠和人类 CYP1A 亚家族在二恶英代谢中的物种差异”Arch。

Inouye, K., Shinkyo, R., Takita, T., Ohta, M.Sakaki, T.: "Metabolism of polyclorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) by human cytochromes P450 dependent monooxygenases"J. Agric. Food Chem.. 50. 5496-5502 (2002)

Inouye, K.、Shinkyo, R.、Takita, T.、Ohta, M.Sakaki, T.：“人细胞色素 P450 依赖性单加氧酶对多氯二苯并-对-二恶英 (PCDD) 的代谢”J。

Shinkyo, R., Sakaki, _T., Takita, T., Ohta, M., Inouye, K: "Generation of 2,3,7,8-TCDD-metabolizing enzyme by modifying rat CYP1A1 through site -directed mutagenesis."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 303. 511-517 (2003)

Shinkyo, R.、Sakaki, _T.、Takita, T.、Ohta, M.、Inouye, K：“通过定点诱变修饰大鼠 CYP1A1 来生成 2,3,7,8-TCDD 代谢酶。”