疾患関連糖鎖遺伝子変異体を用いた分子病態のプロテオーム解析

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糖鎖機能の理解はポストゲノム研究における重要課題の一つであるが,糖鎖分析技術の発達が不十分なことや適切なモデル動物が存在しなかったために,核酸やタンパク質に比べて研究が立ち後れているのが現状である.そこで本研究は,疾患関連糖鎖遺伝子変異体を用いた糖鎖の超微量分析法とプロテオーム解析法を検討し,グリコサミノグリカンの機能発現メカニズムの解明を試みると同時に,その情報を応用することによってヒト疾患における遺伝的要因のゲノム解析と分子病態の理解を目指した.ショウジョウバエ全体をすりつぶしてプロテオーム解析を行うことはこれまで非常に困難であった.我々は本研究に先立って様々な条件検討を行いショウジョウバエ試料に適した二次元電気泳動プロトコールを確立していたが,微量の試料を用いて野生型と変異体のプロテオームを比較するためには,さらなる方法の改良が必要であることが判明した.検討の結果,少量液相等電点電気泳動システムによりpH3.0〜pH5.4,pH5.4〜pH6.2,pH6.2〜pH7.0,pH7.0〜pH10.0に分画後,狭域のIPGストリップを用いて等電点電気泳動を行い,二次元電気泳動解析することにより解析が可能になることが明らかになった.また,狭域のIPGストリップを用いた等電点電気泳動を省いて,SDS-PAGEとLC-MSによる,より定量的で再現性の良い方法の有効性も確認できた.これまで,ショウジョウバエのプロテオグリカンのコアタンパク質を生化学的手法で同定した報告例はなかった.そこでまずコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの同定を試みたところ,pH6.2以下の画分に分子量250kDa以上の複数のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが存在することが明らかになり,現在LC-MSでコアタンパク質を同定中である.