細胞膜上のRGS8/8S反応複合体の分子生物学的解明

细胞膜上RGS8/8S反应复合物的分子生物学解析

• 批准号: 16048232
• 负责人: 齊藤 修
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048232/
• 关键词: RGS; G蛋白質; 受容体; Gq; 小脳; 細胞膜; プルキンエ細胞; カルモジュリン

我々は、G蛋白質制御因子としてGαGAPの作用をもつRGS8とRGS8S(N端部9残基のみが異なる)をクローニングして解析を行ってきた。そして、RGS8が小脳プルキンエ細胞に特異的に高発現していること、Gαiファミリーに結合してGi系の細胞応答を顕著に加速することなどを明らかにしてきた。さらに、最近の研究によって、RGS8は、プルキンエ細胞ではN端を使い分けて様々な蛋白質分子と相互作用して、RGS8反応複合体とRGS8S反応複合体を形成して、特定の細胞膜への移動や受容体選択的なGq制御を行っているものと考えられるようになってきた。そこで本研究では、これらの反応複合体の実体を明らかにするため、次の二つの方向の研究を行った。(1)タグ付きRGS8及びRGS8Sを発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成し、それぞれの反応複合体をタグを利用してアフィニティー精製する。そして結合タンパク群を見つけ出していく。(2)Gタンパク質以外のGqシグナリングに関わる既知の情報伝達因子で、直接RGS8あるいはRGS8Sと相互作用するものはないか検討していく。結果、(1)については、小脳プルキンエ細胞特異的な発現を導くL7プロモーターを用いて、RGS8およびRGS8SのTgマウスを作成中である。これまでに発現レベルの低いマウスしか得られていない。高発現体が胎生致死となる可能性も考えられるため、G蛋白質制御能を失わせた変異体RGS8のTgマウスも作成中である。また、(2)については、極めて興味深い結果が得られた。まずRGS8とRGS8Sの組み換え蛋白質を作成して、カルモジュリンとの結合性を解析した。すると、RGS8がCa^<2+>依存的にカルモジュリンに結合することが明らかになり、しかもN端9残基のみが異なるRGS8Sは反応性が弱いことが判明した。このことは、RGS8の特異的N端部に直接Ca^<2+>/カルモジュリンが結合することを示唆している。また、M1、M2、M3ムスカリン受容体の第三細胞内ループの組み換え蛋白質を用いて、GqあるいはGi系のGPCRとの反応性を解析すると、RGS8がGq系のM1及びM3受容体とは結合するが、Gi系のM2受容体とは結合しないことが判明した。しかも、N端が異なるRGS8Sは、そのGq受容体結合能が低く、さらにN端がないと受容体結合能が著しく減少することが確認された。このようにRGS8が、その特異的N端を中心に相互作用して、細胞膜上でCa^<2+>/カルモジュリンさらに直接Gq受容体を巻き込んだ複合体を形成して、反応特異性を調節している機構が明らかになってきた。

I 々 は, G protein royal factor と し て G alpha GAP の role を も つ RGS8 と RGS8S (N end 9 residues の み が different な る) を ク ロ ー ニ ン グ し analytical line を っ て て き た. そ し て, RGS8 が small 脳 プ ル キ ン エ cells に high specific に 発 now し て い る こ と, G alpha I フ ァ ミ リ ー に combining し て Gi is の cells 応 answer を 顕 the に accelerate す る こ と な ど を Ming ら か に し て き た. さ ら に, recent studies on の に よ っ て, RGS8 は, プ ル キ ン エ cells で は n-terminal を make い points け て others 々 な と protein molecules interact し て, RGS8 応 complex と RGS8S 応 complex を to form し て, specific の membrane へ の mobile や by let body sentaku な Gq suppression を line っ て い る も の と exam え ら れ る よ う に な っ Youdaoplaceholder0 た た. そ こ で this study で は, こ れ ら の anti 応 complex の be body を Ming ら か に す る た め, times の つ の line direction の research を っ た. (1) タ グ pay き RGS8 and び RGS8S を 発 now す る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク (Tg) マ ウ ス を し, consummate そ れ ぞ れ の anti 応 complex を タ グ を using し て ア フ ィ ニ テ ィ ー refined す る. Youdaoplaceholder0 そ て combined with タ パ パ を group を see け け produce て て く く く. (2) G タ ン パ ク mass outside の Gq シ グ ナ リ ン グ に masato わ る の intelligence で 伝 of factors, both directly RGS8 あ る い は RGS8S と interaction す る も の は な い か beg し 検 て い く. Results, (1) に つ い て は, small 脳 プ ル キ ン エ cell specific な 発 now を guide く about プ ロ モ ー タ ー を with い て, RGS8 お よ び RGS8S の Tg マ ウ ス を made in で あ る. Youdaoplaceholder3 れまでに appears レベ レベ られて <s:1> low れまでに ウス ウス られて られて な な. High 発 now body が viviparous death と な る possibility も exam え ら れ る た め, G protein can suppression を lost わ せ た - variant RGS8 の Tg マ ウ ス も made in で あ る. Youdaoplaceholder0, (2)に また て て て, extremely めて interest deeply また result が we get られた. ま ず RGS8 と RGS8S み の group in え protein を made し て, カ ル モ ジ ュ リ ン と の associativity を parsing し た. す る と, RGS8 が Ca ^ 2 + < > dependent に カ ル モ ジ ュ リ ン に combining す る こ と が Ming ら か に な り, し か も n-terminal 9 residues の み が different な る RGS8S は anti 応 が weak い こ と が.at し た. こ の こ と は, RGS8 の specific direct Ca N end に ^ 2 + > < / カ ル モ ジ ュ リ ン が combining す る こ と を in stopping し て い る. ま た, M1, M2, and M3 ム ス カ リ ン by let body の third intracellular ル ー プ み の group in え protein を い て, Gq あ る い は Gi is の GPCR と の anti 応 sex を parsing す る と, RGS8 が Gq is の M1 and び M3 by let body と は combining す る が, Gi is の M2 let body と は combining し な い こ と が.at し た. し か も, n-terminal が different な る RGS8S は, そ の Gq by binding energy for body が low く, さ ら に n-terminal が な い と by binding energy for body が the し く reduce す る こ と が confirm さ れ た. こ の よ う に RGS8 が, そ の specific n-terminal を center に interaction し て, membrane で Ca ^ 2 + < > / カ ル モ ジ ュ リ ン さ ら に direct Gq with let body を 巻 き 込 ん だ complex を form し て 応 specificity and anti を adjust し て い る institutions が Ming ら か に な っ て き た.

项目成果

Molecular cloning and characterization of a new RGS protein of Medaka.

青鳉新 RGS 蛋白的分子克隆和表征。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Gene 345
• 作者: M.Itoh;K.Nagatomo;Y.Kubo;Y.Sugimoto;O.Saitoh
• 通讯作者: O.Saitoh

Characterization of bitter taste responses of intestinal STC-1 cells

• DOI: 10.1093/chemse/bji022
• 发表时间: 2005-05-01
• 期刊: CHEMICAL SENSES
• 影响因子: 3.5
• 作者: Masuho, I;Tateyama, M;Saitoh, O
• 通讯作者: Saitoh, O

Biochemical and electrophysiological analyses of RGS8 function

RGS8功能的生化和电生理分析

• 发表时间: 2004
• 期刊: Methods in Enzymology. 390
• 作者: Saitoh;O.;Kubo;Y.
• 通讯作者: Y.

The mechanism of membrane-translocation of RGS8 induced by Gα expression

Gα表达诱导RGS8膜易位的机制

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Neurochem. 88
• 作者: Norihiro Nakamura;Shingo Tanaka;Yoshinori Teko;Hiroshi Kanazawa;I.Masuho
• 通讯作者: I.Masuho

Ligand-induced rearrangement of the dimeric metabotropic glutamate receptor 1α

• DOI: 10.1038/nsmb770
• 发表时间: 2004-07-01
• 期刊: NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 16.8
• 作者: Tateyama, M;Abe, H;Kubo, Y
• 通讯作者: Kubo, Y