細胞膜上のRGS8/8S反応複合体の分子生物学的解明

细胞膜上RGS8/8S反应复合物的分子生物学解析

• 批准号: 17048031
• 负责人: 齊藤 修
• 金额: $ 4.54万
• 依托单位: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17048031/
• 关键词: RGS; G蛋白質; 受容体; Gq; 小脳; 細胞膜; プルキンエ細胞; カルモジュリン

我々は、GPCR系の制御因子としてGαGAPの作用をもつRGSタンパクファミリーに注目して、特にRGS8とRGS8S(N端部9残基のみが異なる)をクローニングして解析を行ってきた。そして、RGS8が小脳プルキンエ細胞に特異的に高発現していること、Gαiファミリーに選択的に結合すること、さらに細胞内分布については、RGS8が、プルキンエ細胞で何らかの機構によって特定の細胞膜に存在することなどが判明した。また、Gq受容体シグナルの制御能を解析すると、RGS8が、Gαqとは結合性が低いにもかかわらず、各ムスカリンGq受容体に対して受容体選択的なGq抑制能を示し、M1系は抑制するが、M3系の抑制は弱いこと、さらにRGS8SはいずれのGq系にも制御能が弱いことなどが判明した。そこで、プルキンエ細胞では、RGS8は特定の細胞膜で受容体選択的なGq制御を行うために、その特異的N端を介してG蛋白質以外の分子と相互作用してRGS8反応複合体を形成し、またRGS8SはRGS8S反応複合体を形成して機能しているものと考えられた。これらの反応複合体の実体を明らかにすることが、本研究の目標である。そして平成17年までの本研究で、RGS8が、RGS8SにはないN端のMPRR(6〜9残基)の配列をコアにM1ムスカリン受容体などの特定の受容体の第三細胞内ループ(i3)に直接結合し、その直接結合がRGS8の示す調節能にM1受容体への選択的を与える重要な機構であることを、結合実験、BRET解析、電気生理解析で明らかにした。そこで、18年度は、直接結合出来ない受容体系については、どのような機構でRGS8は受容体を選択して調節するか、我々は、未知の因子を介した受容体の間接認識の機構を想定して、新規仲介因子の探索を行った。RGS8をバイトに、イーストTwo-hybrid法で小脳を検索した。すると、25個の陽性クローンが単離され、配列を決定していくとその中に足場蛋白質Spinophilin(SPL)が見出された。SPLは、幾つかの受容体に特異的に結合する事が報告されている足場タンパクである。そこで、まずこのSPLに注目して、SPLのGST融合蛋白質を作成し、これにRGS8と8Sの組み換え蛋白質を反応させ共枕しうるかどうか、結合性を検討した。結果、SPLがRGS8結合性を持っていること、さらにRGS8Sへは殆ど結合しないことが判明した。そこで、RGS8の各種N端欠失変異体を作成して検討した結果、RGS8は前述のM1受容体結合に使うMPRRで、SPLにも結合する事などが明らかになった。これらの知見は、これまでの研究成果を大きく進展させ、「RGS8は、細胞膜上でSPLの関与如何によって制御する受容体がスイッチする複合体システムを持っている」という全く新しい機構を示唆することになった。

I 々 は, GPCR の suppression factor と し て G alpha GAP の role を も つ RGS タ ン パ ク フ ァ ミ リ ー に attention し て, に RGS8 と RGS8S (N end 9 residues の み が different な る) を ク ロ ー ニ ン グ し analytical line を っ て て き た. そ し て, RGS8 が small 脳 プ ル キ ン エ cells に high specific に 発 now し て い る こ と, G alpha I フ ァ ミ リ ー に sentaku に combined す る こ と, さ ら に intracellular distribution に つ い て は, RGS8 が, プ ル キ ン エ cells で what ら か の institutions に よ っ て specific の membrane に exist す る こ と な ど が.at し た. ま た, Gq let body シ グ ナ ル の suppression can を parsing す る と, RGS8 が alpha q, G と は associativity が low い に も か か わ ら ず, various ム ス カ リ ン Gq by let body に し seaborne て by let body sentaku な Gq can inhibit を し, M1 is は inhibit す る が, M3 is の suppression は weak い こ と, さ ら に RGS8S は い ず れ の Gq department に も system The power of the imperial court is が, the weakness of the imperial court is た, the とな is が, and the judgment of the imperial court is た. そ こ で, プ ル キ ン エ cells で は, RGS8 は specific の で cell membrane by let body sentaku な Gq suppression を line う た め に, そ の specific n-terminal を interface し て outside の G protein molecules と interaction し て RGS8 応 complex を form し, ま た RGS8S は RGS8S 応 complex を to form し て function し て い る も の と exam え ら Youdaoplaceholder0. <s:1> れら <s:1> anti応 complex <e:1> entity を name ら にする にする とが とが objective of this study である. そ し て pp.47-53 17 years ま で の で, this study RGS8 が, RGS8S に は な い n-terminal の MPRR (6 ~ 9 residues) の match column を コ ア に M1 ム ス カ リ ン by let body な ど の specific の is の third let body cells ル ー プ (i3) に directly combining し, そ の directly combined が RGS8 の shown す can regulate に M1 by let body へ の sentaku を In collaboration with える important な institutions である である とを, combined with experiments, BRET analysis, and electrical physiology analysis で, ら ら に た た た. そ こ で, 18 year は, directly combined な い by capacity system に つ い て は, ど の よ う な institutions で RGS8 は by let body を sentaku し て adjust す る か, I 々 は, unknown の factor を interface し た の indirectly by let body know の institutions を scenarios し て line, new rules placement factor の exploration を っ た. RGS8をバ トに トに, <s:1> スト ストTwo-hybrid method で small 脳を検 cable た. す る と, 25 の positive ク ロ ー ン が 単 from さ れ, column を decided し て い く と そ の Spinophilin に foot of proteins (SPL) が shows さ れ た. SPL は, several つ か の is let body に specific に combining す る matter が report さ れ て い る foot field タ ン パ ク で あ る. そ こ で, ま ず こ の SPL に attention し て, SPL の GST fusion protein を し, consummate こ れ に RGS8 と 8 s み の group in え protein を anti 応 さ せ altogether pillow し う る か ど う か, associativity を beg し 検 た. Results, SPL が RGS8 associativity を hold っ て い る こ と, さ ら に RGS8S へ は perilous ど combining し な い こ と が.at し た. そ こ で, RGS8 の various n-terminal owe lost - variant を made し て beg し 検 た results, RGS8 は aforesaid の M1 by let body combined with に う MPRR で, SPL に も combining す る matter な ど が Ming ら か に な っ た. こ れ ら の knowledge は, こ れ ま で の research を big き く progress さ せ, "RGS8 は, membrane で SPL の masato and how に よ っ て suppression す る by let body が ス イ ッ チ す る complex シ ス テ ム を hold っ て い る" と い う く all new し い institutions を in stopping す る こ と に な っ た.

项目成果

Molecular cloning and characterization of a new RGS protein of Medaka.

青鳉新 RGS 蛋白的分子克隆和表征。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Gene 345
• 作者: M.Itoh;K.Nagatomo;Y.Kubo;Y.Sugimoto;O.Saitoh
• 通讯作者: O.Saitoh

味覚順応に関わる分子の検索-小腸細胞を用いた試み

寻找参与味觉适应的分子——利用小肠细胞的尝试

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本味と匂学会誌 Vol.12(2)
• 作者: 齊藤修;増保生郎
• 通讯作者: 増保生郎

Functional expression of single-chain heterodimeric G-protein-coupled receptors for adenosine and dopamine

腺苷和多巴胺单链异二聚体 G 蛋白偶联受体的功能表达

• 发表时间: 2005
• 期刊: Cell Struct.Funct. 29
• 作者: T.Kamiya;O.Saitoh;H.Nakata
• 通讯作者: H.Nakata

Characterization of bitter taste responses of intestinal STC-1 cells

• DOI: 10.1093/chemse/bji022
• 发表时间: 2005-05-01
• 期刊: CHEMICAL SENSES
• 影响因子: 3.5
• 作者: Masuho, I;Tateyama, M;Saitoh, O
• 通讯作者: Saitoh, O

Identification of adenosine receptor subtypes expressed in the human endothelial-like ECV304 cells

• DOI: 10.1159/000084547
• 发表时间: 2005-01-01
• 期刊: PHARMACOLOGY
• 影响因子: 3.1
• 作者: Kobayashi, R;Saitoh, O;Nakata, H
• 通讯作者: Nakata, H