未解明生体内蛋白質糖化反応および架橋反応生成物の探索と活性評価

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1.糖とチオール付加反応生成物の同定と生理活性評価:^<13>Cラベル化グルコース、フルクトースとシステイン、グルタチオンなどの生体内チオールと生体内条件下でインキュベートして生成物を同定した。グルコースとグルタチオンでは、中性状態でインキュベートすると、グルコース1位とシステイン残基のチオールとアミノ基がチアゾリジンを形成し、その後グルタミン酸が加水分解されて安定化することが判明した。この化合物を各種細胞に供したが、特に活性は認められなかった。一方、フルクトースとグルタチオンはチアゾリジンを形成しにくく、ケトースとは体内でも反応しにくいことが推側された。グルコースの場合、このようなアダクトを容易に形成した。これまで、システインとグルコースのアダクトは血液中から同定されているが、グルタチオンのアダクトは追求されてない。このin vitroの反応性から考えて、血中でもシステニルグリシンのグルコースアダクトは存在するものと考えられた。2.酸化蛋白質の架橋反応生成物の解析と活性評価:卵殻膜リジルオキシダーゼは蛋白質架橋反応に関与しているのでその反応特性から調べた。その結果、本酵素はアミノ酸のD, L体の区別なく反応し、アミノ酸のαアミノ基には反応しないで、Lys, Ornなどの1級アミノ酸のみに反応することがわかった。この酵素を用いて、蛋白質酸化モデルのα-N-acyl adipic semialdehyde(AAS)およびα-N-acyl gultamic semialdehyde(GGS)を調整し、各種細胞に供したが特に活性は認められなかった。一方、無保護のD-オルニチン(Orn)に本酵素を反応させると、複雑な混合物を与えたが、NMR解析の結果、プロリンなどの代謝物である、D-pyrroline-5-carboxylate(P5C)を主成分として与えることがわかった。また、この化合物は非常に弱いながら(IC_<50>0.1mM程度)caspase-3を阻害することがわかった。L-Ornからも同じ反応条件でNMRで全くD体と同じ生成物が示されたが、L体はこの活性を示さなかった。このことからCaspase-3阻害活性はD-アミノ酸代謝物の未知の生理活性であることが示唆された。3.蛋白質の酸化程度を定量する方法の確立と応用蛋白質酸化で生じるAAS, GGSをp-aminobenzoic acidで蛍光ラベル化し、イミンを還元後に蛍光HPLCで定量する方法を完成した。