ヒガンフグ筋肉ナトリウムチャンネルcDNAの発現とその特性の解析

彼岸河豚肌钠通道cDNA的表达及其特性分析

基本信息

批准号：
10760043
负责人：
山下まり
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760043/
关键词：
ヒガンフグ Na^+チャンネルテトロドトキシン筋肉

项目摘要

ヒガンフグ筋肉Na+チャンネルType2では、全長(6735bp,1880aa)に相当するcDNA断片を得てその塩基配列を決定した。次にそれらの断片の結合を行い、完了した。結合後の塩基配列の確認を2回行った。また、一方、そのアミノ酸配列を基に2種の抗ペプチド抗体を作製した。そのcDNAをT7プロモーターを有する発現ベクター(pcDNA3)に組み込み、ヒト胎児腎臓由来TSA-201細胞にトランスフェクションし、発現を試みたが、現在のところ、抗ペプチド抗体でバンドは検出されていない。この原因として、他のNa+チャンネル研究者から情報を集めたが、これまでも、Na+チャンネルの発現実験では、発現することができない例は多く、翻訳開始部の構造が問題らしい。現在も試行錯誤を繰り返している。一方、nt1376-3302の領域の2箇所において、Alternative splicingがあることが、この領域を含むRT-PCRの結果から判明した。各、クローンの塩基配列の解析から4つのパターンがあり、1のパターンのみ全長の蛋白質をコードしていた。この現象がpseudogeneやmultigeneによらないことは、Southern blotで各制限酵素で1つのバンドしかでなかったことから裏付けられた。発現を試みたcloneはこの部分をRT-PCRから得た断片で全長をコードするように置き換えたが、それが発現しない一つの原因として疑われる。

在河豚肌肉的Na+通道类型2中，获得了与总长度相对应的cDNA片段（6735 bp，1880 aa），并确定了碱基序列。然后将碎片组合并完成。结合后的核苷酸序列已确认两次。另一方面，根据氨基酸序列制备了两种类型的抗肽抗体。将cDNA掺入携带T7启动子的表达载体（PCDNA3）中，并转染到人胎肾衍生的TSA-2013细胞中，并试图表达它，但没有用抗肽抗体检测到频带。这是因为问题，尽管从其他NA+通道研究人员收集了信息，但在许多情况下，无法表达NA+通道上的表达实验，而翻译起始区域的结构似乎是一个问题。我仍在尝试进行反复试验。另一方面，RT-PCR结果表明，在NT1376-3302区域的两个位置有一个替代剪接。每个克隆的基本序列分析有四种模式，只有1个模式编码了全长蛋白。这种现象不是由假基因或多基因引起的，这证明，在南部印迹中，每个限制酶只有一个频带。试图表达这一部分的克隆被从RT-PCR获得的片段代替以编码全长，但这被认为是无法表达其表达的原因之一。