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生体分子のパスウェイ・ネットワークの光制御法の確立

生物分子通路网络光控方法的建立

基本信息

批准号：
18016029
负责人：
古田寿昭
金额：
$ 4.74万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子の発現を時空間的に制御する手法は生命現象を理解する上で非常に有用である。遺伝子発現関連分子を光分解性保護基によって機能的にマスキングし,光照射によって回復する技術によって高い時空間分解能で実現できると期待される。Caging試薬であるBhc-diazoはDNAのリン酸と反応して、Bhc基により修飾されたcaged DNAを形成する。caged DNAはUV照射によるBhc基の切断によって初めて転写の鋳型となると予想される。しかしcaged DNAを用いた光による発現制御は再現性に乏しく、このことはin vitroにおいてDNAのcagingの程度を示す有効な指標がないことに一因がある。そこで,DNAのcagingの指標を得ること,およびcaged pDNAを用いて哺乳類培養細胞において遺伝子発現を光制御することを目指した。caged pDNAはpDNAをBhc-diazo溶液と混和し遮光条件下で反応させることで得た。通常DNAは熱に対して安定であり94℃で加熱しても電気泳動パターンにはほとんど影響が見られないが、caged pDNAでは加熱により泳動バンドがスメアになることから、高温により断片化すると考えられる。それに対しUV照射によるuncaged DNAでは加熱後もバンドが観察された。そこでこの熱不安定性をcagingの指標として条件設定を行い,再現性よくプラスミドDNAを合成する条件を確立することができた。得られたcaged pDNAを用いて,in vitroおよびin vivoにおける遺伝子発現の光誘導を試みた。その結果,in vitroの系でも,HeLa細胞内においても,UV照射により用いたレポータ遺伝子の発現を数倍以上増大させることに成功した。またcaged DNAの熱不安定性がcagingの指標として有効であることも示された。

It is very useful to understand the phenomenon of life by controlling the time and space of evolution. The development of molecular photodecomposition protection groups is expected to be achieved by light irradiation and high spatial decomposition. Caging test: Bhc-diazo modification of DNA caged DNA is cleaved by UV irradiation. Caged DNA is used to detect and control the reproducibility of DNA in vitro. DNA caging is an indicator of the use of mammalian cells in culture to control gene expression. caged pDNA and pDNA mixed in dark DNA is usually heated to 94 ° C, and then electrophoresis is affected. DNA is heated to 94 ° C, electrophoresis is affected, and DNA is fragmented at high temperatures. For example, when exposed to UV radiation, unaged DNA is detected after heating. The index of thermal instability and the condition of DNA synthesis are established. The obtained caged pDNA can be used to test the light-induced discovery of genetic proteins in vitro and in vivo. As a result,in vitro and in HeLa cells,UV irradiation increased the production of DNA by several times. The thermal instability of caged DNA is an indicator of its stability.