モルフォゲンの濃度勾配ロバストネス保証および分化運命決定における閾値の分子機構

形态素浓度梯度鲁棒性保证和分化命运决定阈值的分子机制

基本信息

批准号：
20022020
负责人：
石橋誠
金额：
$ 4.67万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

モルフォゲン濃度勾配のロバストネスの実験的検証:モルフォゲン濃度勾配形成のロバストネスに関しては、Elderらの提唱した数理モデルがあるが、Shhについてこのモデルの検証を行った。このモデルはShhの産生が多く、且つ分解が非線形の場合を想定しているが、Shhの勾配のプロフィールが通常の線形の分解の場合と比べてどうなっているのか、理論側から実験的な計測ができるような予測を立て、実際にReal time PCR,ウェスタンブロット、ELISA等によって測定した。実際に比較する領域としては、剖出の際に領域を個体間の差なくきちんと定義しやすい肢芽と肺を用いた。どちらの器官においてもShhがパターン形成に重要な働きをしていることが分かっている。その結果、gene doseが半分であるヘテロ接合体では、SHHの産生量が野生型の半分になっていた。これは前述のモデルと矛盾する結果であるが、詳細な検討の結果、検出されているSHHタンパクは細胞内の前駆体であることが分かった。実際に機能する細胞外のタンパクは今のところ検出限界以下である。従ってモデルの検証にいたらず、細胞外のタンパクを可視化・定量化することを試みている。この方法を確立した後、神経管においても測定する予定である。上述の理論予測ではShhの量が多い場合にしか勾配が安定に保たれないが、予備的実験において肺におけるShhのタンパク量は肢芽や神経管における量よりもかなり少ないことが分かっている。従って、肺のパターン形成では先ほどの理論の前提と合わないことが起こっている可能性がある。更に、実際のタンパクの分布を計測するために、免疫組織化学の方法の改良を試みた。現在行っている免疫組織化学の手法では、細胞外に放出されたシグナル因子が固定の段階でうまく周辺の構造にトラップされず、Shhの産生細胞内のタンパクは検出できても濃度勾配は検出されない。拡散しているタンパク分子を固定して可視化する方法の開発を試みたが成功していない。

形态浓度梯度的鲁棒性的实验验证：Elder等人提出了一个数学模型，并验证了SHH。该模型假设SHH产生更多，并且分解是非线性的，但是我们做出了预测，可以从理论方面进行实验测量，以确定如何将SHH梯度的特征与正常线性分解的情况进行比较，并实际上使用实时PCR，Western Blot，Elisa等实际上进行了测量。发布。已经发现，SHH在两个器官的模式形成中都起着重要作用。结果，在一半基因剂量的杂合子中，SHH的产量量减半，野生型的一半。这是上述模型的矛盾结果，但是经过详细的检查，发现检测到的SHH蛋白是细胞内前体。实际功能的细胞外蛋白目前低于检测极限。因此，我们不是试图验证模型，而是试图可视化和量化细胞外蛋白。建立此方法后，还将在神经管中进行测量。上述理论预测表明，只有在大量SHH时梯度才稳定，但是在初步实验中，发现肺中的SHH蛋白量显着低于肢体芽和神经管中的SHH蛋白。因此，肺模式可能与上述理论的前提不符。此外，尝试改进免疫组织化学方法来测量实际蛋白质分布。在当前的免疫组织化学技术中，在固定阶段，在细胞以外释放的信号因子并未成功捕获在周围的结构中，并且可以检测到产生SHH的细胞中的蛋白质，但未检测到浓度梯度。我们试图开发一种通过固定的方法来可视化扩散蛋白分子的方法，但尚未成功。