運動失調症シュータントによる障害機構の分子生物学的研究

共济失调射击损伤机制的分子生物学研究

基本信息

批准号：
63623506
负责人：
御子柴克彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

小脳プルキンI細胞の樹状突起、棘突起形成及び顆粒細胞とのシナプス形成に重要な役割を果していると考えられるP400蛋白質をddYマウス小脳から精製し、3種のモノクローン抗体を作成した。この抗体を用いて、正常マウス脳組織における発現を免疫組織化学的手法により解析したところ、P400蛋白質の発現は小脳プルキンI細胞に特徴的であり、生後3日目頃から21日まで、プルキンI細胞樹状突起の発達とともにその発現が増大することが観察された。また、細胞内の局在を免疫電顕により調べた結果、P400蛋白質はプルキンI細胞の細胞膜及び小胞体膜に局在しており、とくにシナプス後膜に豊富に存在することが認められた。また、P400蛋白質はcAMP依存性蛋白質リン酸化酵素により、リン酸化を受けるが、Ca^<2+>-Calmodulin依存性蛋白質リン酸化酵素では殆どリン酸化を受けなかった。以上の結果は、P400蛋白質がcAMP依存性蛋白質リン酸化酵素により機能調節を受ける膜貫通蛋白質であることを示唆している。つぎに、3種のモノクローン抗体を利用して、マウス小脳cDNAライブラリーより、P400蛋白質に対するcDNAクローンを単離し、塩基配列を決定するとともに全アミノ酸配列について推定した。その結果、P400蛋白質は2749個のアミノ酸よりなるポリペプチドであり、3種のモノクローン抗体に対するエピトープがN末端側の679-727、943-1237及びN末端側2648-2749に位置していることを明らかにした。また、疎水性ドメインの探索から、7ヶ所の推定膜貫通部位の存在が認められるとともに、これらの疎水性ドメインのアミノ酸配列が従来報告されているG蛋白の膜貫通部位、また、ナトリウムチャンネルの膜貫通部位とかなりの類似性を示すことが認められた。以上の結果は、P400蛋白質がプルキンI細胞の情報伝達系に何らかの重要な役割を持つ受容体様膜蛋白質であることを示唆するものである。

p400蛋白被认为在树突形成，棘突过程和突触中与小脑紫金I细胞中的突触起着重要作用。使用该抗体，通过免疫组织化学技术分析了正常小鼠脑组织中的表达。据观察，P400蛋白的表达是小脑Purkin I细胞的特征，并且其表达随着Purkin I细胞树突的发展而增加，从生命的第三天到第21天。此外，当通过免疫电子显微镜检查细胞内的定位时，发现P400蛋白位于Purkin I细胞的细胞膜和内质网膜上，并且在突触后膜中尤其丰富。此外，P400蛋白通过CAMP依赖性蛋白磷酸化经历磷酸化，但几乎没有CA^<2+> - 钙调蛋白依赖性蛋白磷酸化的磷酸化。以上结果表明，p400蛋白是一种跨膜蛋白，受CAMP依赖性蛋白磷酸酶调节。接下来，使用三种单克隆抗体，从小鼠小脑cDNA文库中分离出P400蛋白的cDNA克隆，确定碱基序列，并估计整个氨基酸序列。结果，P400蛋白是由2,749个氨基酸组成的多肽，据揭示了三种单克隆抗体的表位位于N-Terminus上的679-727、943-1237和2648-2749。此外，寻找疏水结构域揭示了存在七个推定的跨膜部位，并且发现这些疏水结构域的氨基酸序列与先前报道的G蛋白的跨膜位点具有相当相似的相似性。以上结果表明，P400蛋白是一种受体样膜蛋白，在Purkin I细胞的信号系统中具有重要作用。