細胞内カルシウム動態に関わる新規機能分子の構造と機能の解析

细胞内钙动力学相关新型功能分子的结构和功能分析

• 批准号: 03F00778
• 负责人: 御子柴 克彦
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00778/
• 关键词: IP_3R; IRBIT; 免疫沈降; プルダウン実験; NBC1

IP_3Rに結合する新規のタンパク質を同定し、アービット(IRBIT)と名付け2003年に発表した。このIRBITに結合する物質を抗体を用いてマウスの小脳から同定した結果、ナトリウム/炭酸水素共トタンスポター(NBC1)に相当するアミノ酸配列が検出された。その結果を基にNBC1とIRBITの結合様式を明らかにすることにした。NBC1抗体によるIRBIT結合の確認NBC1には3種のタイプが存在するが、その3種とも脳内で発現している。免疫沈降実験の結果、pNBCとbNBCがIRBITと結合することが明らかとなった。kNBCが結合しなかったことからpNBCとbNBCに存在しkNBCにはないN末領域のアミノ酸部分がIRBITに結合するのだろうと類推された。NBC/IRBIT/IP_3R三量体形成NBCもIP_3Rと同様にIRBITが結合することから、脳内でこの3つの分子がコンフォメーションを形成している可能性が考えられた。そこでマウス小脳で抗NBC抗体を用いて免疫沈降実験を行った結果、IP3Rも共沈してくることが確認された。さらに強制発現蛋白質でのプルダウン実験でも同じ結果が得られ、その上IP3RとNBCは直接には結合せずIRBITを介して始めて結合が確認された。強制発現NBCタンパク質でのプルダウン実験NBC1-MBPタンパク質の強制発現ベクターを作製し作為的に合成した蛋白質とIRBITとの結合確認実験を行った。コントロールにはpNBCにMBPを結合させたタンパク質を用い、N末端側の領域が重要であることを示すために1残基から88残基目のアミノ酸を含むpNBCとbNBCには共通領域だがkNBCには存在しないタンパク質を用いて共沈してくるIRBITの量を測定した。その結果、N末端領域は全長のタンパク質と同等量のIRBITに結合し、その領域が結合部位である確証が得られた。

IP_3R was launched in 2003 in conjunction with the new regulation on the same quality as IRBIT. The IRBIT binding substance antibody was used to determine the reaction time, reaction time and reaction time of the IRBIT binding substance. NBC1 and NBC2 IRBIT binding to NBC1 antibody confirms the presence of three types of antibodies in NBC1. The results of immune sedimentation, pNBC and bNBC are irbit. kNBC is a combination of two parts, i.e. pNBC and bNBC. NBC/IRBIT/IP_3R triad formation NBC/IP_3R triad formation The results of IP3R co-precipitation were confirmed. In addition, the protein expression of the stress gene was detected by IP3R and NBC directly. NBC1-MBP protein protein binding confirmation procedure for the synthesis of protein and IRBIT pNBC is a common domain. The results showed that the total length of the N-terminal domain was determined by the same amount of IRBIT.