プロテインキナーゼCによるチロシンキナーゼの燐酸化さその活性制御に関する研究

蛋白激酶C调控酪氨酸激酶磷酸化活性的研究

• 批准号: 63641522
• 负责人: 武田 誠郎
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-63641522/
• 关键词: プロテインキナーゼC; チロシンキナーゼ; 原癌遺伝子c-src; pp60^<c-src>; 神経細胞型pp60^<c-src>; pp60^<c-src+>; タンパク質のリン酸化; 細胞情報伝達機

プロテインキナーゼCの精製はラット脳シトゾルよりDE-52、トレオニン-セファローズ、TSKgelPhenyl-5PW、TSKgelG3000SWを用いて電気泳動的に均質に精製した。プロテインキナーゼCの生理的基質の一つと考えられる原癌遺伝子c-srcの産物には従来種々の組織に見い出されているpp60^<c-src>とそのN端末側に6つのアミノ酸の挿入された、神経細胞にのみ見い出されているpp60^<c-src+>とがある。プロテインキナーゼCによるこれら2種のpp60^<c-src>のリン酸化反応を検索する目的で、ラット脳顆粒画分よりこれらを分離精製した。チロシンキナーゼ活性は、Tyr-Glu(1:4)ポリマーを基質として測定した。チロシンキナーゼを顆粒画分より2%Nonidet P-40-0.5M Naclを含む緩衝液で定量的に可溶化し、SephacrylS-300のゲル濾過、レクチンアガロース処理後、casein-Toyopearlのカラムクロマトで5つの活性ピーク(酵素1-5)に分離した。この内、酵素3及び4がc-src産物に特異的に反応する単クローン抗体(MAb327)と免疫沈降した。酵素3と4は同じカラムの再クロマトで完全に分離された。酵素3と4の比活性は685unit/mg、1850unit/mgで顆粒画分よりそれぞれ6.4倍、17倍精製された。更にアンフォライン等電点電気泳動カラムで酵素3と4はそれぞれ純度5%、25%に精製され、両者の等電点はいずれも6.6であった。酵素3と4の自己リン酸化バンドはSDS-PAGEでそれぞれ60kDa及び61kDaを示し、A-キナーゼリン酸化した後のV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップから酵素3がpp60^<c-src>、酵素4がpp60^<c-src+>と推定された。pp60^<c-src>とpp60^<c-src+>をそれぞれ精製したプロテインキナーゼCでリン酸化し、SDS-PAGEによるV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップにより分析すると、両者はN末側34kDaにリン酸化部位があることがわかった。リン酸化部位の決定、リン酸化による活性変化の解析を計画している。

TSKgelPhenyl-5PW, TSKgelG3000SW are used in the homogeneous purification of electrophoresis. A study of the physiological matrix of the proto-oncogene c-src <c-src>is carried out in the tissue of the seed, and a study of the N-terminal end of the cell is carried out in the tissue of the seed. 2 kinds of acid reaction system for the purpose of separation and <c-src>purification The activity of Tyr-Glu(1:4) was measured. The enzyme was solubilized in 2% Nonidet P-40-0.5M NaCl buffer solution, filtered by Sephacryl S-300, treated with enzyme, and isolated from casein-Toyopearl. These enzymes 3 and 4 are c-src products-specific antibodies (MAb327) and immune sedimentation. Enzymes 3 and 4 are completely isolated. The specific activity of enzyme 3 and 4 was 685unit/mg and 1850unit/mg, respectively. The isoelectric point of the enzyme is 5% and 25%, respectively. The enzyme 3 and 4 are expressed in SDS-PAGE as 60kDa and 61kDa respectively, and <c-src>the enzyme 4 is expressed in pp60^and 61 kDa respectively. pp60 <c-src>^&lt;c-src+&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt; Determination of Acidification Site, Analysis of Acidification Activity and Planning

项目成果

Hirofumi,Usui: FEBS Letters. 184. 60-64 (1985)

臼井宏文：FEBS 信件。

Haruhisa,Tsukamoto: Journal of Biochemistry. 104. 807-816 (1988)

Haruhisa，冢本：生物化学杂志。

Kazunori Yoshikawa: Journal of Biological Chemistry. 260. 15091-15099 (1985)

吉川一典：生物化学杂志。

Hirofumi Usui: "Cellular Regulation and Malignant Growth" Japan Sci.Soc.Press,Tokyo/Springer-Verlag,Berlin, 503 (1985)

Hirofumi Usui：“细胞调节和恶性生长”Japan Sci.Soc.Press，Tokyo/Springer-Verlag，Berlin，503 (1985)