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プロテインホスファターゼ2Aの活性制御に関する研究

蛋白磷酸酶2A活性调控研究

基本信息

批准号：
09877026
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1) B"の試験管内リン酸化部位の決定(武田分担)-ヒト赤血球サイトゾル画分よりPP2A(ACB")を当教室で確立した方法で均質に精製した。精製酵素を試験管内でオカダ酸の存在下,[γ-32P]ATPを用いてA-キナーゼでリン酸化した。リン酸化B"をSDS-PAGEで他のサブユニット,酵素より分離し,リジンエンドペプチダーゼで消化後,リン酸化消化ペプチドをC^<18>逆相カラムで分離し,そのアミノ酸配列を決定した。B"の推定一次構造よりB"のリン酸化部位をSer-60,Ser-75,Ser-573と決定した。2) B"のリン酸化による活性変化の解析(碓井分担)-精製したACB"を150mM KCl存在下でATPを用いてA-キナーゼでリン酸化し,A-キナーゼでリン酸化したH1ヒストン,H2Bヒストン,ホスホリラーゼを基質として,リン酸化による活性変化を解析した。その結果,B"のリン酸化により,これらの基質に対する特異性の変化が見られた。3) B"結合蛋白質の検索(西藤分担)-B"とGAL4タンパク質のDNA結合ドメインとの融合タンパク質を発現するプラスミドを出芽酵母Y190に導入する。これにGAL4タンパク質の転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現するヒト大脳cDNAライブラリーを導入し,レポーター遺伝子HIS3の発現を指標にスクリーニングを行い,B"と結合するタンパク質のcDNAを単離し,解析中である。4) 分裂酵母のB"に対応する遺伝子破壊株の作成と解析(田邉分担)-分裂酵母のB"ホモログであるpbpl^+とpbp2^+の2つの遺伝子をPCRにより単離し,選択マーカーのura4^+遺伝子を挿入した後,分裂酵母のura4^-変異株に導入しpbpl^+とpbp2^+遺伝子破壊株を作成した。この遺伝子破壊株には形態,増殖能に異常が見られ,ヒトB"遺伝子の導入によりこの異常は救済された。

1)Determination of Acidification Site in B"Test Tube (Takeda Share)-Determination of Erythrocyte Acidification Site (PP2A)(ACB") In the presence of [γ-32P]ATP, the purified enzyme is used in the presence of [γ-32P]ATP. Rinen acidified B"" SDS-PAGE "" his support "", the enzyme is separated, and after digestion, Rinen acidified digestion "" is separated "" C "" <18>reverse phase "", and the acid sequence is determined. B's putative primary structure is determined by Ser-60,Ser-75,Ser-573. 2)Analysis of the activity change of B "in the presence of 150mM KCl-purification of ACB" in the presence of ATP in the presence of A-, H1-,H2-, H3-, H4-, H4, H4-, H4, H4 As a result,B"was acidified, and the substrate specificity was changed. 3)B"binding protein (Saito share)-B" GAL4 "protein DNA binding protein" fusion protein "development" selection "selection" budding yeast Y190 "introduction. The expression of GAL4 protein was activated, the fusion protein was generated, and the cDNA was introduced into the system. The expression of GAL4 protein was detected by PCR. The cDNA was isolated and analyzed. 4)Preparation and analysis of the B"mutant strain of the split yeast (shared by Tian Yan)-Two strains of pbpl^+ and pbp2 ^+ are found on the B" stalk of the split yeast. After PCR is performed, the ura4^+ strain of the split yeast is selected and inserted, and the ura4^-mutant strain of the split yeast is introduced into the pbpl^+ and pbp2^+ mutant strain to prepare the mutant strain. This is the first time that a plant has been infected with a virus.