DNA-PK、ATMの転写調節解析とその結果を利用した放射線感受性制御・予測

点击翻译按钮获取中文摘要

放射線によりDNAには様々な損傷が生じるが、付着細胞の生死(増殖死)を決定するのはDNA2本鎖切断であることがわかっている。DNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。ヒトの細胞では主に非相同的末端再結合機構によりDNA2本鎖切断が修復されていることを明らかにした。術前未治療の大腸癌12例を用いて非相同的末端再結合機構の最初のステップであるDNA-PKと転写因子Sp1の蛋白質量を調べた。その結果、Sp1の蛋白質量はKu70、Ku80、DNA-PKcsの蛋白質量/mRNA量との間で相関が認められた。この結果とKu70、Ku80、DNA-PKcsの蛋白質量が互いに相関することから、Sp1によりKu70、Ku80、DNA-PKcsの転写が調節されている可能性が考えられた。そこで、Ku70、Ku80、DNA-PKcsのプローモーター領域にSp1 binding siteが有るかどうかを検討したところ、Ku70、Ku80、DNA-PKcsはプロモータ領域に複数のSp1 binding siteを持つことが明らかになった。そこで、Sp1とSp3がKu70、Ku80、DNA-PKcsの転写調節や放射線感受性に及ぼす影響を検討するために、Sp1とSp3のsenseとdominant negativeの遺伝子をクローニングした。senseのSp1とSp3はpcDNA4/HisMaxを発現ベクターとして用いた。dominant negativeのSp1とSp3は過剰発現すると細胞増殖が停止し、目的としたクローンが得られないことが報告されているので、発現ベクターとしてはGeneSwich systemのpGene/V5-Hisを用いた。PCRにより得られたクローンをベクターに挿入済みで、シークエンスを確認した。Sp1とSp3を過剰発現した場合とdominant negativeのSp1とSp3によりそれらの活性を阻害した場合のDNA-PK蛋白発現に対する影響と放射線感受性に対する影響を検討した。