生体眼における蛍光抗体標識及びその画像化に関する基礎的研究

活体眼荧光抗体标记及其成像基础研究

基本信息

批准号：
09877334
负责人：
小椋祐一郎
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877334/
关键词：
白血球蛍光抗体網膜循環

项目摘要

網膜において虚血再灌流後には血管内皮には様々な接着分子が発現し、白血球の集積に関与していると考えられている。これまで網膜虚血再灌流後に網膜血管内皮に発現している接着分子の検討は生化学的、または組織学的な方法に限定されていた。そこで、今回我々は網膜血管内皮に発現している接着分子intracellular adhesion molecule-1(ICAM-1)、P-selectinの発現を生体内で観察し、定量する方法を試みた。方法としては抗ICAM-1抗体、抗P-selectin抗体をFLUOTAGを用いてFITCで標識した。1mgの抗体を緩衝液内でFITCと室温下に2時間かけ結合させた。Sephadex G-25Mカラムにより結合しなかったFITCを除去し、FITC標識された抗体を分離した。有色Long-Evansラットに対し、全身麻酔下に視神経結紮術により60分の網膜虚血を作成した後、再灌流させた。様々な再灌流時間の後、再び、全身麻酔下に尾静脈にカテーテルを留置し、標識した抗体を2mg/kg投与した。ラットの眼底は走査型レーザー検眼鏡(SLO)を用いてargon laserを励起光として観察し、動画としてS-VHSビデオテープに録画した。SLOによって得られた画像はコンピューターに取り込み、画像解析ソフトを用いて種々の解析を行った。励起光のargon laserの強度、filterゲインを様々に変化させたが、今回の研究ではSLOによりFITC標識された抗ICAM-1抗体、抗P-selectin抗体の蛍光を充分なコントラストでとらえることはできなかった。励起光のargon laserの強度を更に強くし、抗体分子に対する、FITC分子の結合比率を更に大きくすることにより、ICAM-1、P-selectinの発現を生体内で観察することが可能になる可能性があると考えられた。

视网膜缺血再灌注后，在血管内皮中表达了各种粘附分子，被认为参与白细胞的积累。到目前为止，视网膜缺血和再灌注后在视网膜血管内皮中表达的粘附分子的研究仅限于生化或组织学方法。因此，我们试图观察和量化细胞内粘附分子-1（ICAM-1）和P-选择素的表达，这些表达在体内在视网膜血管内皮中表达。作为一种方法，使用Fluotag将抗ICAM-1抗体和抗P-选择蛋白抗体标记。 1 mg的抗体在室温下与缓冲液的FITC结合2小时。通过Sephadex G-25M色谱柱去除未结合的FITC，并分离了FITC标记的抗体。有色长鹰大鼠通过视神经结扎，然后再灌注在全身麻醉下是视网膜缺血60分钟。在不同的再灌注时间之后，将导管再次放在全身麻醉下，将标记的抗体施用2 mg/kg。使用使用氩激光作为激发光的扫描激光眼镜（SLO）观察大鼠眼底，并在S-VHS录像带上记录为视频。通过SLO获得的图像被导入到计算机中，并使用图像分析软件进行了各种分析。尽管激发光的氩激光的强度和滤波器增益以各种方式改变了，但在这项研究中，不可能捕获具有足够对比度的FITC标记的抗ICAM-1抗体和抗P-选择蛋白抗体的荧光。通过进一步增加激发光的氩激光的强度，并增加了FITC分子与抗体分子的结合比，人们认为可以观察到体内ICAM-1和P-组蛋白的表达。