光誘導技術を利用した生体内神経細胞間ネットワークの人工構築法の開発

本申請研究では，光照射による軸索の誘導法の確立を目的とした．具体的には，申請者がこれまでに開発した軸索伸長を担う受容体タンパク質DCCを光照射によって活性化する分子，PA-DCC (photo-activatable DCC)を改良することで，神経細胞において光照射により効率的に軸索伸長を誘発する手法を確立することを目指した．まず, PA-DCC分子が軸索誘導能を有することを確認するため，ニワトリ胎児由来後根節神経細胞にPA-DCCを導入した. 伸長途中にあるPA-DCCを発現した軸索の先端部にある成長円錐の一部に，青色光を断続的に照射した．その後の伸長方向の変化を屈曲角として定量化し解析を行ったところ，光照射側へと誘導されることを確認できた．次に, 生きた個体内でも光照射による軸索誘導能が可能であることを検証するため，線虫を用いた実験を実施した．まずPA-DCC分子内のDCCを線虫由来のDCC (UNC-40と呼ばれる)に交換し，新たにPA-UNC-40を作成した．作成した分子を軸索誘導能を失った線虫に導入し，トランスジェニック線虫株を樹立した．発生途中のトランスジェニック線虫を麻酔処理し，生きたまま共焦点顕微鏡下で観察した．伸長途中の成長円錐の一部に青色光を断続的に照射した．照射後の成長円錐の移動量を重心軌跡より解析したところ，統計的に有意に光照射側へと移動することが確認できた．また，周囲に神経索と呼ばれる物理的障壁がある場合には，神経索に沿った方向に照射した時のみ成長円錐の誘導が観察された．本結果は，周囲の環境と軸索誘導との関係を本手法により直接解析可能であることを示している．このように, PA-DCC分子を用いることで生きた個体内における光照射による軸索誘導を世界に先駆けて実現し，生体組織内での軸索誘導機構の解明に貢献する可能性を示すことができた．

本申請研究では，光照射による軸索の誘導法の確立を目的とした．具体的には，申請者がこれまでに開発した軸索伸長を担う受容体タンパク質DCCを光照射によって活性化する分子，PA-DCC (photo-activatable DCC)を改良することで，神経細胞において光照射により効率的に軸索伸長を誘発する手法を確立することを目指した．まず, PA-DCC分子が軸索誘導能を有することを確認するため，ニワトリ胎児由来後根節神経細胞にPA-DCCを導入した. 伸長途中にあるPA-DCCを発現した軸索の先端部にある成長円錐の一部に，青色光を断続的に照射した．その後の伸長方向の変化を屈曲角として定量化し解析を行ったところ，光照射側へと誘導されることを確認できた．次に, 生きた個体内でも光照射による軸索誘導能が可能であることを検証するため，線虫を用いた実験を実施した．まずPA-DCC分子内のDCCを線虫由来のDCC (UNC-40と呼ばれる)に交換し，新たにPA-UNC-40を作成した．作成した分子を軸索誘導能を失った線虫に導入し，トランスジェニック線虫株を樹立した．発生途中のトランスジェニック線虫を麻酔処理し，生きたまま共焦点顕微鏡下で観察した．伸長途中の成長円錐の一部に青色光を断続的に照射した．照射後の成長円錐の移動量を重心軌跡より解析したところ，統計的に有意に光照射側へと移動することが確認できた．また，周囲に神経索と呼ばれる物理的障壁がある場合には，神経索に沿った方向に照射した時のみ成長円錐の誘導が観察された．本結果は，周囲の環境と軸索誘導との関係を本手法により直接解析可能であることを示している．このように, PA-DCC分子を用いることで生きた個体内における光照射による軸索誘導を世界に先駆けて実現し，生体組織内での軸索誘導機構の解明に貢献する可能性を示すことができた．