ビタミンD依存性Ca結合蛋白質の分離精製と遺伝子クローニング

维生素D依赖性Ca结合蛋白的分离纯化及基因克隆

• 批准号: 60223009
• 负责人: 野々村 禎昭
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Special Project Research
• 财政年份: 1985
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1985 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-60223009/
• 关键词: ビタミンD; カルシュウム結合蛋白質; 小脳; 腎; 28Kダルトン蛋白質; DEAEカラムクロマトグラフィー

1.目的 生体内に存在するCa結合蛋白質(CBP)のうちビタミンD依存性で分子量28Kダルトンの小脳よりの分離精製を試み、腎臓から精製されたビタミンD依存性CBPと比較し、遺伝子DNAクローニングへの準備を行う。2.方法 牛小脳及び腎の低イオン強度抽出物を飽和硫安70〜100%分画を集め120mMNaCl、トリス塩酸10mM(pH7.4)、EGTA0.1mMに透析、同液で平衡化したDEAEセルローズカラムに適用、同液で洗い、次いでNaClのみ90mMに下げ良く洗った。次いでCa【Cl_2】でEGTAをおきかえ流出した分画をCa-45-オートラジオグラフィーで、ニトロセルロース紙に転写した各分画SOSPAGE標本として観察した。3.結果 Ca【Cl_2】で流出した分画は28Kの単一バンドで強くCa-45でラベルされたCBPであった。この分画は小脳、腎共に全く同様にふるまった。ビタミンD欠乏ラットの小脳、腎について同様の分画を行い、一方同欠乏ラットに活性型ビタミンDを投与して抽出分画を行ったところ、腎では欠乏で28Kの減少、ビタミンD投与で28Kの誘導が明らかであったが、小脳では欠乏、投与で全く変化がみられなかった。4.考察 非常に特殊なDEAEカラムクロマトグラフィーでビタミンD-依存性CBPが精製出来たが、これはこの28K蛋白質がCaの有無で等電点が変化することで説明出来る。この28K蛋白質は従来迄小腸、腎、小脳に存在することはわかっていたがその精製は小腸と腎では成功していたが小脳では我々の発表がはじめてである。この牛小脳28KCBPのアミノ酸一次構造を現在決定中で、一部情報がわかったところで合成オリゴヌクレオタイドを作成、cDNAクローニングの為のプローブとしての用意が完了した。

Purpose 1. Born in vivo に exist す る Ca binding protein (CBP) の う ち ビ タ ミ ン D molecular weight dependence で 28 k ダ ル ト ン の small 脳 よ り の separation of refined を try み is crucial, kidney か ら refined さ れ た ビ タ ミ ン D dependency CBP と compare し, but 伝 DNA ク ロ ー ニ ン グ へ を line う の preparation. 2. Method Small cattle 脳 and low び renal の イ オ ン strength extract を sulfur saturation, 70 ~ 100% points draw を め 120 mmnacl, ト リ ス acid salt 10 mM (pH7.4 slightly), EGTA0.1 mM に dialysis, with liquid で equilibration し た DEAE セ ル ロ ー ズ カ ラ ム に apply, with liquid で い い, times で NaCl の み 90 mM に げ Youdaoplaceholder0 wash った. Time い で Ca で Cl_2 】 【 EGTA を お き か え outflow し た points draw を Ca - 45 - オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー で, ニ ト ロ セ ル ロ ー ス paper に planning write し た specimens of each painting SOSPAGE と し て 観 examine し た. 3. The results Ca で outflow Cl_2 】 【 し た painting は 28 k の 単 a バ ン ド で strong く Ca - 45 で ラ ベ ル さ れ た CBP で あ っ た. The <s:1> <s:1> fraction of 脳 is small 脳, and the renal に is all く the same にふるまった. ビ タ ミ ン D owe lack ラ ッ ト の small 脳, kidney に つ い て with others in painting line を い の points, one side with owe spent ラ ッ ト に activity type ビ タ ミ ン D を cast with し painting line を っ て spare points た と こ ろ, kidney で は owe lack で 28 k の reduce, ビ タ ミ ン D cast with で 28 k の induced が Ming ら か で あ っ た が, small 脳 で は owe lack, cast and で く variations change が み ら れ な か っ Youdaoplaceholder0. 4. Inspection is very special な に DEAE カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で ビ タ ミ ン D - dependence CBP が refined out た が, こ れ は こ の 28 k protein が Ca の presence of で isoelectric point が variations change す る こ と で る instructions. こ の 28 k protein は 従 effect to the small intestine, kidney, small 脳 に exist す る こ と は わ か っ て い た が そ の refined は small intestine と renal で は successful し て い た が small 脳 で は I 々 の 発 table が は じ め て で あ る. こ の veal 脳 28 KCBP の ア ミ ノ acid in the determination of a tectonic を now で, an intelligence が わ か っ た と こ ろ で synthetic オ リ ゴ ヌ ク レ オ タ イ ド, cDNA を ク ロ ー ニ ン グ の is の プ ロ ー ブ と し て の intention が finished し た.

项目成果

ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. 151-1. (1985)

分析生物化学。