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ビタミンD依存性Ca結合蛋白質の分離精製と遺伝子クローニング

维生素D依赖性Ca结合蛋白的分离纯化及基因克隆

基本信息

批准号：
60223009
负责人：
野々村禎昭
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1985
资助国家：
日本
起止时间：
1985 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.目的生体内に存在するCa結合蛋白質(CBP)のうちビタミンD依存性で分子量28Kダルトンの小脳よりの分離精製を試み、腎臓から精製されたビタミンD依存性CBPと比較し、遺伝子DNAクローニングへの準備を行う。2.方法牛小脳及び腎の低イオン強度抽出物を飽和硫安70〜100%分画を集め120mMNaCl、トリス塩酸10mM(pH7.4)、EGTA0.1mMに透析、同液で平衡化したDEAEセルローズカラムに適用、同液で洗い、次いでNaClのみ90mMに下げ良く洗った。次いでCa【Cl_2】でEGTAをおきかえ流出した分画をCa-45-オートラジオグラフィーで、ニトロセルロース紙に転写した各分画SOSPAGE標本として観察した。3.結果 Ca【Cl_2】で流出した分画は28Kの単一バンドで強くCa-45でラベルされたCBPであった。この分画は小脳、腎共に全く同様にふるまった。ビタミンD欠乏ラットの小脳、腎について同様の分画を行い、一方同欠乏ラットに活性型ビタミンDを投与して抽出分画を行ったところ、腎では欠乏で28Kの減少、ビタミンD投与で28Kの誘導が明らかであったが、小脳では欠乏、投与で全く変化がみられなかった。4.考察非常に特殊なDEAEカラムクロマトグラフィーでビタミンD-依存性CBPが精製出来たが、これはこの28K蛋白質がCaの有無で等電点が変化することで説明出来る。この28K蛋白質は従来迄小腸、腎、小脳に存在することはわかっていたがその精製は小腸と腎では成功していたが小脳では我々の発表がはじめてである。この牛小脳28KCBPのアミノ酸一次構造を現在決定中で、一部情報がわかったところで合成オリゴヌクレオタイドを作成、cDNAクローニングの為のプローブとしての用意が完了した。

1. Objective To isolate and purify Ca-binding protein (CBP), which is present in vivo and has a molecular weight of 28K, and to compare and prepare CBP for purification of CBP. 2. Methods The low intensity extracts of bovine serum and kidney were separated by 70 ~ 100% saturated sulfuric acid, 120 mM NaCl, 10mM citric acid (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, dialysis, equilibration in the same solution, and washing in the same solution. In the second place, Ca [Cl_2] is divided into two parts: Ca-45 and Ca-45. 3. The results showed that Ca [Cl_2] efflux was 28K and the concentration of Ca-45 was 28 K. The two sides of the road are the same. In addition, the active type of the active type. 4. A very special DEAE protein was examined. The D-dependent CBP was purified and the isoelectric point of Ca was determined. The 28K protein is present in the small intestine, kidney and intestine. The primary structure of KCBP was determined, and the purpose of synthesis was completed.