小脳のプルキンエ細胞に内在するシナプス形成因子の研究

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小脳のプルキン工細胞は特異な形態を有しているが、スタゲラー突然変異マウス小脳にはプルキン工細胞に特異なP400蛋白質が欠損しており、プルキン工細胞と保行線維とのシナプスが形成できない。我々はシナプス形成にP400蛋白質が重要な役割を有しているものと考え、この蛋白質の解析を試みた。まずP400蛋白質の代謝的性質を明らかにするため【^(14)C】-ロイシンでパルスラベルして蛋白質解析を行なったところ、正常では比較的良くラベルされることが正常小脳で認められたが、プルキン工細胞の欠損シュータントであるpcdマウス小脳ではP400蛋白質に相当する位置には【^(14)C】-ロイシンでラベルされたバンドはみいだされなかった。一方staggererでもP400蛋白質に一致する部位に【^(14)C】-ロイシンのとりこみは全く観察されなかった。すなわちstaggererでは蛋白質そのものが合成されていないことが示唆された。また分離プルキン工細胞を用いて内在性のリン酸化反応を調べたところリン酸化される蛋白質であることがあきらかとなった。更にP400蛋白質の性質を詳細に調べるために、この蛋白質の精製を試みた。細胞分画によってP31画分を得た。これをTritonX100処理後、超遠心して得られた沈査を蛋白分解酵素阻害剤及び界面活性剤を含む塩酸グアニジン溶液で可溶化し、セファロースCL4B,COnAセファロースによるクロマトグラフィーで単一バンドにまで精製できた。P400蛋白質の構造、機能解析に用いる目的で、SDS-ポリアクリルアミドケル電気泳動L;P400蛋白質のバンドを切り出した。これをBALB/Cマウスに免疫し定法に従って抗体産生株を得た。この内の一つは、ウエスタンブロット解析によりP400蛋白質に相当する分子量の蛋白質を認識するlgGを産生することがわかった。