遺伝子工学によるリゾチームの酵素機能の徹底的解明と機能変換

ニワトリリゾチームに種々の変異を導入し, その機能の解明と交換を目的に以下の実験を行った. 前年度には大腸菌内で変異リゾチームを大量に発現させるシステム(菌体タンパク質の約25%), および変性状態で得られる変異リゾチームを活性構造に巻き戻すためのグルタチオンの酸化還元システムを確立した. しかしこの巻戻しシステムはAla31→Va1の変異リゾチームが巻戻らず, また試薬が高価で大量の巻戻しには不都合なものであった. 本年度は(1)巻戻しシステムの改良を行い, グルタチオンよりはるかに安価なメルカプトエタノールを用いる大量巻戻しシステムの開発に成功した. またグルタチオンのシステムに1M尿素を加えることで上記変異リゾチームを約30%の収率で巻戻すことにも成功した. (2)リゾチームの触媒基がGlu35とAsp52であることはすでに報告したが, さらにこれらのカルボキシル基の位置関係の重要性を調べるためにGlu35→Asp, Asp52→Gluおよび両方同時に置換した変異リゾチームを調製し, それらの性質を調べたところ, 活性はいずれも誤差の範囲で認められなかった. またGlu35を性質の似ているヒスチジンで置換した場合も活性がほとんど認められなかった. これらの結果よりGlu35およびAsp52の機能は他の類似のアミノ酸では代用できないと結論した. しかし活性部位にあるもう一つのカルボキシル基であるAsp101をリジンで置換しても活性は低下しなかった. (3)(2)で調製した変異リゾチームは酸性プロテアーゼおよびセリンプロテアーゼへの機能変換をも目指したものなので, まずそれらのエステラーゼ活性を調べるためにリゾチームの触媒基の近傍に結合できるエステル基質をいくつかデザインし合成した. 大量に変異リゾチームが調製でき次第それらのエステラーゼ活性を測定する予定である.

ニワトリリゾチームに種々の変異を導入し, その機能の解明と交換を目的に以下の実験を行った. 前年度には大腸菌内で変異リゾチームを大量に発現させるシステム(菌体タンパク質の約25%), および変性状態で得られる変異リゾチームを活性構造に巻き戻すためのグルタチオンの酸化還元システムを確立した. しかしこの巻戻しシステムはAla31→Va1の変異リゾチームが巻戻らず, また試薬が高価で大量の巻戻しには不都合なものであった. 本年度は(1)巻戻しシステムの改良を行い, グルタチオンよりはるかに安価なメルカプトエタノールを用いる大量巻戻しシステムの開発に成功した. またグルタチオンのシステムに1M尿素を加えることで上記変異リゾチームを約30%の収率で巻戻すことにも成功した. (2)リゾチームの触媒基がGlu35とAsp52であることはすでに報告したが, さらにこれらのカルボキシル基の位置関係の重要性を調べるためにGlu35→Asp, Asp52→Gluおよび両方同時に置換した変異リゾチームを調製し, それらの性質を調べたところ, 活性はいずれも誤差の範囲で認められなかった. またGlu35を性質の似ているヒスチジンで置換した場合も活性がほとんど認められなかった. これらの結果よりGlu35およびAsp52の機能は他の類似のアミノ酸では代用できないと結論した. しかし活性部位にあるもう一つのカルボキシル基であるAsp101をリジンで置換しても活性は低下しなかった. (3)(2)で調製した変異リゾチームは酸性プロテアーゼおよびセリンプロテアーゼへの機能変換をも目指したものなので, まずそれらのエステラーゼ活性を調べるためにリゾチームの触媒基の近傍に結合できるエステル基質をいくつかデザインし合成した. 大量に変異リゾチームが調製でき次第それらのエステラーゼ活性を測定する予定である.