動原体DNAの段階的除去・改変による減数分裂染色体分配の素過程の解析

着丝粒DNA逐步去除和修饰分析减数分裂染色体分离的基本过程

• 批准号: 63540501
• 负责人: 丹羽 修身
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63540501/
• 关键词: 分裂酵母; 動原体; ミニ染色体

分裂酵母染色体動原体は反復DNA配列を多く含むので、染色体ウォーキングのような方法での構造解析は困難である。本研究では大腸菌などへのクローニングを用いないで、ゲノム構造を直接解析する方法を開発した。分裂酵母ゲノムには8塩基対認識制限酵素NotIの切断位置は14ケ所しかない。そこで相同組換えによるプラスミドの組込み形質転換を利用して、動原体近傍にNotI認識DNA配列を導入した。次にNotIで完全消化後、別の制限酵素で限定分解し、DNA断片をPFGで分離、プラスミドDNAをプローブとしてサザン法で調べた。この方法で分裂酵母の3本の染色体の動原体における、反復DNA配列の構造とその配置が解明された。本研究で用いたミニ染色体が含むcen3は120kbの領域に約6kbの単位が10数コピー含まれていた。我々が先に作成した120kbのミニ染色体Ch10はまさにこの領域のみを含む。Ch10DNAの末端は、両側とも、復配列の内部にあった。Ch10DNAに上述の方法でNotI切断配列を導入し、構造を解析した。その結果、染色体III動原体と基本的に同じ構造をもつことが確められた。Ch10に遺伝的マーカーを導入して有系分裂における安定性を測定したところ、脱落の頻度は分裂あたり0.1%以下であった。Ch10は有糸分裂だけでなく減数分裂においても安定に保持されるが、相同染色体の対合能はほぼ完全に失っているようである。一方、動原体反復領域の全部を含む150kbのDNAを、530kbのミニ染色体から一段階遺伝子置換法で除去し、400kbの直線状DNAを作成した。これは予想通り極めて不安定であり、分裂あたり0.2以上の頻度で脱落した。以上の結果から、反復配列領域だけで動原体機能を果せること、この領域の存在が染色体の安定化に必須であることがわかった。今後はさらに細かい領域に欠失を導入するなどして、動原体機能に必須のDNA配列を同定する必要がある。

Split yeast chromosome agents body は repeated DNA match column を く more contain む の で, chromosome ウ ォ ー キ ン グ の よ う な method で の structure は difficult で あ る. This study で は coliform な ど へ の ク ロ ー ニ ン グ を with い な い で, ゲ ノ を ム structure directly parse す る method を open 発 し た. Saccharomyces ゲノムに 8 base pair recognizes the restriction enzyme NotI <s:1> cleavage site ゲノムに 14ケ な な ケ. そ こ で in same group え に よ る プ ラ ス ミ ド の group 込 み form quality planning in を using し て, move the body nearly alongside に NotI known DNA match column を import し た. Time に NotI で completely digested, the limitations don't の enzyme decomposition し で limit, DNA fragment を PFG で separation, プ ラ ス ミ ド DNA を プ ロ ー ブ と し て サ ザ ン method で adjustable べ た. The <s:1> method で of splitting yeast <s:1> three <s:1> chromosomes <s:1> actiplasma における, repeated DNA coordination <s:1> structure とそ <s:1> configuration が explanation された. This research で い た ミ が ニ chromosomes contain む cen3 は 120 KB に の field about 6 KB の 単 a が number 10 コ ピ ー containing ま れ て い た. I 々が first に to make a <s:1> た120kb <s:1> ニ ニ chromosome Ch10 まさに まさに <s:1> domain <e:1> みを containing む. The ends of the Ch10DNA strand are にあった, the sides are と と, and the inside of the compound sequence strand is にあった. Ch10DNAに the above <s:1> method でNotI cut and arranged を import で, construct を analysis た た. The そ そ result, the basic に and じ structure of the chromosome III kinetoplasma と, を じ められた とが とが とが とが とが indeed められた. Ch10 に but 伝 マ ー カ ー を import し て have department division に お け る stability determination of を し た と こ ろ, fall off の frequency は split あ た り below 0.1% で あ っ た. Ch10 は have si split だ け で な く meiosis に お い て も settle に keep さ れ る が, same chromosome の can us seaborne は ほ ぼ entirely に lost っ て い る よ う で あ る. Side, move the body repeatedly field の を む 150 KB の を DNA, all 530 KB の ミ ニ chromosome か ら traces of a Duan Jie 伝 son displacement method で remove し, 400 KB の linear DNA を made し た. <s:1> れ, めて is unstable めて, あた is split, あた is 0.2 or more <s:1>, で is detached, た is た. の above results か ら, repeated match column field だ け で dynamic function of the original body を fruit せ る こ と, こ の field の is の が chromosome stabilization に must で あ る こ と が わ か っ た. Future は さ ら に fine か に owe い field loss を import す る な ど し て, dynamic function of the original body に must set す を の DNA match column with る necessary が あ る.

项目成果

J.B.Fan;et al.: Nuc.Acids Res.in press.

J.B.Fan；等人：Nuc.Acids Res.in press。