オルニチン脱炭酸酵素アンチザイムの役割-遺伝子導入による解析-

鸟氨酸脱羧酶抗酶的作用-基因转移分析-

基本信息

批准号：
01570143
负责人：
村上安子
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アンチザイムはオルニチン脱炭酸酵素(ODC)の反応生成物ポリアミンによって誘導される蛋白質であり、ODCに特異的に結合してこれを不活性化する。われわれはアンチザイムとの結合がODCの迅速な分解の引金になる可能性を示唆してきた。本研究では下記のように遺伝子導入法によって、アンチザイムはポリアミンによるODC分解の加速に必要な蛋白質であることを直接的に証明した。(1)アンチザイム全長cDNAのクロ-ニングすでに得られていた部分長のcDNAをプロ-ブとして、新たに作製したラット肝ライブラリ-から最長1.1kbのアンチザイムcDNAをクロ-ニングした。プライマ-伸長法によりmRNAのcap部位は本cDNAの5'端の14ヌクレオチド上流であることが示され、本cDNAはほぼ完全長とみなされた。大腸菌直接発現系における本cDNA産物はアンチザイム活性を有した。(2)アンチザイムcDNAの遺伝子導入アンチザイムcDNAを、デキサメサゾンにより制御可能なMMTV-LTRプロモ-タ-をもつ発現ベクタ-に組み込み、これをCHO細胞にリン酸カルシウム法で導入した。G418選択後デキサメサゾンによってアンチザイムが誘導される安定な形質転換細胞が得られた。この細胞にODCを誘導後デキサメサゾンを添加するとODCが消失した。(3)アンチセンスDNAによる内在性アンチザイム遺伝子発現の抑制当初計画していた化学合成アンチセンスオリゴヌクレオチド(15〜20ヌクレオチド)によるアンチザイム遺伝子発現の抑制を試みたが、抑制効果が得られなかった。そこでアンチザイムcDNAを逆向きに上記発現ベクタ-に組み込み、アンチセンスアンチザイムmRNAを発現させた。この形質転換細胞においてはデキサメサゾン処理後プトレッシンによるODC分解の加速効果が消失した。

抗酶是由多胺诱导的蛋白，鸟类脱羧酶（ODC）的反应产物，该蛋白特异性结合并失活的ODC。我们已经提出，与抗酶的结合可能会触发ODC的快速降解。 In this study, we directly demonstrated that antizymes are proteins necessary for accelerated ODC degradation by polyamines by gene transfer methods as follows: (1) Cloning of full-length antizyme cDNA using the partially length cDNA that had already been obtained as a probe, antizyme cDNA with a maximum length of 1.1 kb was cloned from a newly prepared rat liver library.引物扩展方法表明，mRNA的帽位点是cDNA 5'端上游的14个核苷酸，并且将cDNA视为几乎全长。大肠杆菌直接表达系统中的cDNA产物具有抗活性。（2）转导抗蛋白cDNA将抗酶cDNA与MMTV-LTR启动子一起掺入表达载体中，该载体可以由地塞米松控制，并使用磷酸钙方法将其引入CHO细胞中。在选择后通过地塞米松诱导抗卵形，获得了稳定的转化细胞。将ODC诱导到这些细胞后，将地塞米松添加到细胞中，而ODC消失了。（3）通过反义DNA抑制内源性抗酶基因表达，我们试图通过最初计划的化学合成反义寡核苷酸（15-20个核苷酸）来抑制抗卵基因表达，但没有获得抑制作用。因此，将抗酶cDNA掺入上述表达载体，并在相反的方向上掺入，并表达反义抗酶mRNA。在这些转化的细胞中，地塞米松治疗后，抑制蛋白的加速作用消失了。