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オルニチン脱炭酸酵素アンチザイムの役割-遺伝子導入による解析-

鸟氨酸脱羧酶抗酶的作用-基因转移分析-

基本信息

批准号：
01570143
负责人：
村上安子
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アンチザイムはオルニチン脱炭酸酵素(ODC)の反応生成物ポリアミンによって誘導される蛋白質であり、ODCに特異的に結合してこれを不活性化する。われわれはアンチザイムとの結合がODCの迅速な分解の引金になる可能性を示唆してきた。本研究では下記のように遺伝子導入法によって、アンチザイムはポリアミンによるODC分解の加速に必要な蛋白質であることを直接的に証明した。(1)アンチザイム全長cDNAのクロ-ニングすでに得られていた部分長のcDNAをプロ-ブとして、新たに作製したラット肝ライブラリ-から最長1.1kbのアンチザイムcDNAをクロ-ニングした。プライマ-伸長法によりmRNAのcap部位は本cDNAの5'端の14ヌクレオチド上流であることが示され、本cDNAはほぼ完全長とみなされた。大腸菌直接発現系における本cDNA産物はアンチザイム活性を有した。(2)アンチザイムcDNAの遺伝子導入アンチザイムcDNAを、デキサメサゾンにより制御可能なMMTV-LTRプロモ-タ-をもつ発現ベクタ-に組み込み、これをCHO細胞にリン酸カルシウム法で導入した。G418選択後デキサメサゾンによってアンチザイムが誘導される安定な形質転換細胞が得られた。この細胞にODCを誘導後デキサメサゾンを添加するとODCが消失した。(3)アンチセンスDNAによる内在性アンチザイム遺伝子発現の抑制当初計画していた化学合成アンチセンスオリゴヌクレオチド(15〜20ヌクレオチド)によるアンチザイム遺伝子発現の抑制を試みたが、抑制効果が得られなかった。そこでアンチザイムcDNAを逆向きに上記発現ベクタ-に組み込み、アンチセンスアンチザイムmRNAを発現させた。この形質転換細胞においてはデキサメサゾン処理後プトレッシンによるODC分解の加速効果が消失した。

The enzyme products of decarboxylase (ODC) are induced by protein and inactivated by specific binding of ODC. The possibility of rapid decomposition of ODC by combination of ODC and ODC is demonstrated. In this study, we note that the introduction of ODC into the protein system is necessary to accelerate the decomposition of ODC. (1)The full-length cDNA was obtained from the cDNA library, and the partial cDNA library was prepared from the cDNA library with the longest length of 1.1 kb. The mRNA cap region is located at the 5'end of the cDNA. This cDNA product has the ability to express E. coli directly. (2)Introduction of cDNA into CHO cells by the method of gene transfer The G418 selection process is to induce stable and qualitative changes in cells. The ODC was added to the cell. (3)The inhibition of gene expression in the endogenous gene of DNA was studied in the initial planning and chemical synthesis of DNA. The expression of the cDNA of the gene is reversed, and the mRNA of the gene is detected. The accelerated effect of ODC decomposition disappeared after the treatment.