DNAプローブクロマトグラフィーによるがん遺伝子のDNA診断法の開発

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DNAプローブクロマグラフィー(DPC)は、合成DNAオリゴヌクレオチドを末端で支持体に固定したカラムを用いて温度勾配により核酸サンプルを塩基配列に応じて溶出させる高性能アフィニティクロマトグラフィーである。30分という短い時間で、僅か一塩基だけ塩基配列が異なるサンプルを分離することが出来る。本研究ではこのDPCを用いてがん遺伝子をDNAの塩基配列のレベルで診断する方法の開発を行ない平成4年度は以下の成果を得た。1.非多孔性担体の使用により溶出ピークの幅が1/5に縮まり、DPCの分解能が一層向上した。このため、信頼性の高い診断が行なえるようなった。2.片方のプライマーの5'末端をFITCでラベルしたのち、非対称PCRによりラベルした鎖が過剰になるように増幅してからDPCを行なった。溶出された増幅DNA断片をFITCの蛍光で検出したところ、実用的な診断に必要な検出感度を得ることが出来た。3.PCR増幅DNA断片の長さを100塩基以下にすれば、診断の際にサンプルがつくる構造の影響を避けられることがわかった。サンプルDNAが安定な二次構造を形成することにより固定化DNAプローブに結合する部位が隠されてしまうと、サンプルDNAの固定化DNAプローブへの結合速度・結合率が落ちるために、DPCによる検出感度が著しく低下してしまう。長さや二次構造の安定性がいろいろと異なるPCR増幅DNA断片をもちいてその影響を詳しく調べたところ、PCR増幅DNA断片が500塩基と長くしかも安定な構造をつくる場合、サンプルの二次構造をこわす方法を施しても十分にきれいなDPCクロマトグラムは得られなかった。それに対してPCR増幅DNA断片が100塩基程度以下の場合には、二次構造をつくるサンプルであっても、95℃で5分間処理してから注入する方法だけできれいなDPCクロマトグラムを得ることが出来た。