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骨格筋および心筋におけるジストロフィン遺伝子の発現調節に関する分子生物学的研究

骨骼肌和心肌肌营养不良蛋白基因表达调控的分子生物学研究

基本信息

批准号：
05770421
负责人：
吉田邦広
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1994
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は以下の2つの可能性について検討した。(1)ジストロフィン遺伝子の5'端のalternative transcriptionにより心筋特異的なジストロフィンのアイソフォームが存在する可能性についてジストロフィンのN端にはエクソン2を共通に有する3つのアイソフォームが知られており、それぞれ異なるプロモーターにより転写調節を受けている。心筋特異的なアイソフォームの存在を確認するため正常心筋より精製したmRNAから5'-RACE法を用いてエクソン2の5'側のcDNA断片をクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、エクソン2の5'端には骨格筋型のエクソン1の配列が確認され、ジストロフィンの心筋特異的なアイソフォームは否定的と考えられた。(2)ジストロフィンのイントロン1内に転写制御部位が存在する可能性について今回はイントロン1の5'端寄りに存在するMEF2(Myocyte-specific Enhancer 2)結合モチーフに注目して検討した。MEF2はMyoDファミリーにより誘導され、筋管細胞以降に発現する組織特異的な転写因子である。骨格筋型ジストロフィンのプロモーター部分の機能を見るために部分的に切り取ったdeletion mutantsを作成し、おのおのの下流にレポーター遺伝子としてCAT遺伝子をつなぎ、筋芽細胞に導入してその活性を測定した。次にMEF2結合モチーフをつないだコンストラクトを作成し、同様に筋芽細胞に導入してCAT活性を測定した。その結果、TATAボックスやCrAGボックスを含む-100〜+68のコンストラクトが最も高いCAT活性を示した。このコンストラクトにMEF2結合モチーフをつないだところさらに数倍のCAT活性の上昇を認めた。培養系の血清濃度を変えて検討したところMEF2結合モチーフをつないだコンストラクトでは血清濃度が減少するにつれてCAT活性の上昇が見られた。以上より骨格筋においてはMEF2結合モチーフがジストロフィン遺伝子の転写活性化に関与していることが推察された。今後は心筋細胞への遺伝子導入実験よりMEF2結合モチーフの意義をさらに検討する予定である。

This year, the following two possibilities were discussed. (1)The 5'-terminal alternative transcription of the gene is based on the possibility of existence of the specific gene in the heart, and the N-terminal alternative transcription of the gene is based on the possibility of existence of the common gene in the heart. To confirm the presence of a specific cDNA fragment, the 5'-RACE method was used to determine the 5'-side cDNA fragment of a normal cDNA fragment. The result is that the 5'end of the solution 2 is the same as the 5' end of the solution 1. The configuration of the solution 1 is confirmed. The solution 2 is the same as the configuration of the solution 1. The solution 2 is the same as the configuration of the solution 1. The solution 2 is the same as the configuration of the solution 1. (2)MEF2 (Myocyte-specific Enhancer 2) combines the possibility of the existence of the control position in the first part of the second part of the first part of the second part of the second part of the third part of the fourth part of the fourth MEF2 is a tissue-specific transcription factor that is induced by MyoD and expressed in vascular cells. The function of the part of the tendon type is observed, and the deletion mutants are produced, and the downstream part of the tendon type is detected. The activity of the CAT gene is measured. MEF2 was prepared in combination with MEF2, and CAT activity was measured in the same way as MEF2. As a result, the highest CAT activity was found in the range of-100 to +68. MEF2 is a combination of CAT activity and CAT activity. The serum concentration of the culture system decreased due to MEF2 binding and CAT activity increased due to the decrease in serum concentration. The above mentioned MEF2 binding mechanism is related to the activation of MEF2 binding mechanism. In the future, we will discuss the significance of MEF2 in the introduction of gene into muscle cells.