Porphyromonas gingivalis リコンビナント線毛の発現と精製

牙龈卟啉单胞菌重组菌毛的表达及纯化

• 批准号: 05771512
• 负责人: 藤原 卓
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771512/
• 关键词: Porphyromonas gingivalis; 線毛; 組み換えタンパク; PCR

使用菌株としてPorphyromonas gingivalis381,ATCC33277,BH18/10,HW24D1,OMZ314,OMZ409,ATCC49417,6/26,HG564を用いた.P.gingivalis381株の線毛遺伝子(fimA)のDNA塩基配列をもとにプライマーを設計した.各菌株より抽出した染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ,いずれの株からも約1.3kbのDNA断片が増幅された.このPCR産物を各種ベクターに組込み,E.coliDH5およびJM109株に形質転換した.ベクターと宿主の組み合わせで得られたクローンについてその発現量とクローンの安定性を比較した.その結果pUC19をベクターとして用いたり,宿主としてE.coliDH5株を用いた場合ではクローニングされたfimAは非常に不安定であった.低コピー数ベクターのpMW119を用いた場合安定ではあるが,発現量が非常に少なかった.発現のためにTrcプロモーターを持ち,同時にlacIリプレッサーを持つpTrc99と,宿主側にもlacIリプレッサーを持つE.coliJM109株との組み合わせが安定な発現を示したが,組換え線毛の発現量はあまり多くなかった.各菌株由来のfimAのDNA塩基配列をジデオキシ法で決定した.比較してみるとfimAのオープンリーディングフレームの上流および下流域では,ほとんど同一であったが,fimA部分では変化が見られ大きく4つのグループに分類できた.DNA塩基配列の解析によればfimAは大腸菌の典型的なプロモーター構造を上流に持たず,開始コドンも一般的なATGではなくGTGであり,これが組み換えタンパクの発現が弱い原因と考えられた.そこで開始コドンをATGに変換し,pTrc99のTrcプロモーター直後にfimAがつながるようプライマーを設計した.PCR産物をクローニングするとこのクローンでは多量の組換えタンパクの発現量が見られた.なお本研究で得られた各P.gingivalis fimA遺伝子のDNA塩基配列はDDBJDNA data bankにAccession No.D17794-D17802で登録した.

Strain と てPorphyromonas​ Youdaoplaceholder5 を を design た. Each strain よ り spare し た chromosome DNA を テ ン プ レ ー ト と し PCR line を っ て た と こ ろ, い ず れ の strains か ら も about 1.3 KB の DNA fragment が rights of さ れ た. こ を の PCR products of various ベ ク タ ー に group 込 み, e.c. with our fabrication: oliDH5 お よ び JM109 strains に form quality planning in し た. ベ ク タ ー と host の group み わ せ で have ら れ た ク ロ ー ン に つ い て そ の 発 now quantity と ク ロ ー ン の stability を compare し た. そ の results pUC19 を ベ ク タ ー と し て in い た り, host と し て oliDH5 strains of e.c. with our fabrication: を with い た occasions で は ク ロ ー ニ ン グ さ れ た fimA は very に unrest で あ っ た. Number of low コ ピ ー ベ ク タ ー の pMW119 を with い た occasions settle で は あ る が, 発 now fewer が very に な か っ た.​ The origin of each strain is determined by the <s:1> fimA <e:1> DNA base arrangement をジデ キシ キシ method で. Compare し て み る と fimA の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム の upper お よ び basin under で は, ほ と ん ど same で あ っ た が, fimA part で は variations change が see ら れ big き く 4 つ の グ ル ー プ に classification で き た. DNA salt base with column の parsing に よ れ ば fimA は coliform の typical な プ ロ モ ー タ ー を high-class に construction Hold た ず, start コ ド ン も general な ATG で は な く GTG で あ り, こ れ み が group in え タ ン パ ク の 発 が weak い reason now と exam え ら れ た. そ こ で began コ ド ン を ATG に variations in し, pTrc99 の Trc プ ロ モ ー タ ー straight after に fimA が つ な が る よ う プ ラ イ マ ー を design し た. PCR products を ク ロ ー ニ ン グ す る と こ の ク ロ ー ン で は の group in abundant え タ ン パ ク の 発 quantity が now see ら れ た. な お で this research have ら れ た each P.g ingivalis fimA heritage 伝 の salt base with DNA sequence は DDBJDNA data bank に Accession No.D17794-D17802で log in to た.

项目成果

Fujiwara et al.: "Molecular cloning and sequencing of the fimbrilin gene of Porphyromonas gingivalis strains and characterization of recombinant proteins." Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 197. 241-247 (1993)

Fujiwara 等人：“牙龈卟啉单胞菌菌株 fimbrilin 基因的分子克隆和测序以及重组蛋白的表征。”