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Porphyromonas gingivalis リコンビナント線毛の発現と精製

牙龈卟啉单胞菌重组菌毛的表达及纯化

基本信息

批准号：
05771512
负责人：
藤原卓
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771512/
关键词：
Porphyromonas gingivalis 線毛組み換えタンパク PCR

项目摘要

使用菌株としてPorphyromonas gingivalis381,ATCC33277,BH18/10,HW24D1,OMZ314,OMZ409,ATCC49417,6/26,HG564を用いた.P.gingivalis381株の線毛遺伝子(fimA)のDNA塩基配列をもとにプライマーを設計した.各菌株より抽出した染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ,いずれの株からも約1.3kbのDNA断片が増幅された.このPCR産物を各種ベクターに組込み,E.coliDH5およびJM109株に形質転換した.ベクターと宿主の組み合わせで得られたクローンについてその発現量とクローンの安定性を比較した.その結果pUC19をベクターとして用いたり,宿主としてE.coliDH5株を用いた場合ではクローニングされたfimAは非常に不安定であった.低コピー数ベクターのpMW119を用いた場合安定ではあるが,発現量が非常に少なかった.発現のためにTrcプロモーターを持ち,同時にlacIリプレッサーを持つpTrc99と,宿主側にもlacIリプレッサーを持つE.coliJM109株との組み合わせが安定な発現を示したが,組換え線毛の発現量はあまり多くなかった.各菌株由来のfimAのDNA塩基配列をジデオキシ法で決定した.比較してみるとfimAのオープンリーディングフレームの上流および下流域では,ほとんど同一であったが,fimA部分では変化が見られ大きく4つのグループに分類できた.DNA塩基配列の解析によればfimAは大腸菌の典型的なプロモーター構造を上流に持たず,開始コドンも一般的なATGではなくGTGであり,これが組み換えタンパクの発現が弱い原因と考えられた.そこで開始コドンをATGに変換し,pTrc99のTrcプロモーター直後にfimAがつながるようプライマーを設計した.PCR産物をクローニングするとこのクローンでは多量の組換えタンパクの発現量が見られた.なお本研究で得られた各P.gingivalis fimA遺伝子のDNA塩基配列はDDBJDNA data bankにAccession No.D17794-D17802で登録した.

The strain used is としてPorphyromonas gingivalis381,ATCC33277,BH18/10,HW24D1,OMZ314,OMZ409,ATCC49417,6/26,HG564. A) DNA base arrangement design and design. Each strain is extracted from the chromosomal DNA of the PC Rを行ったところ,いずれの区からもabout 1.3kbのDNA fragmentがincreased widthされた.このPCR productをvariousベクターにassemble＾み, E.coliDH5 およびJM109 strain にmorphic substance change した. The current amount of いてその発 is compared with the stability of した.その result pUC19をベクターとして Use いたり, the host is としてE.c The oliDH5 strain is suitable for use in various situations. The fimA is very unstable and has a low number of pM. W119 is used in situations where it is stable and stable, and the current amount is very small. lacI リプレッサーをhold つpTrc99と, host side にもlacI リプレッサーをhold つE.coliJM109 strain との组み合わせが安恪発行をshow したが, 组组え线毛の発现quantity はあまり多くなかった. のfimAのDNA from which each strain is derived The base arrangement is determined by the method of comparison. mA's upper and lower basinでは, ほとんど Same であったが, fimA part では変化が见られ大きく4つのグループにClassification できた.DNA base arrangementのANALYSIS によればfimA は coliform の TYPICAL なプロモーター STRUCTURE を UPPER MATCH たず, BEGIN コドンも GENERAL なATG ではなくGTGであり,これが组みchangeえタンパクの発appears to be weak because of the reason why it is tested.そこでstarts コドンをATGに変changeし,pT rc99のTrcプロモーター正后にfimAがつながるようプライマーをDesignした.PCR productをクローニングすP.gingivalis fimA DNA base alignment DDBJDNA data bank Accession No.D17794-D17802 login.