Porphyromonas gingivalis リコンビナント線毛の発現と精製

牙龈卟啉单胞菌重组菌毛的表达及纯化

基本信息

批准号：
05771512
负责人：
藤原卓
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771512/
关键词：
Porphyromonas gingivalis 線毛組み換えタンパク PCR

项目摘要

使用菌株としてPorphyromonas gingivalis381,ATCC33277,BH18/10,HW24D1,OMZ314,OMZ409,ATCC49417,6/26,HG564を用いた.P.gingivalis381株の線毛遺伝子(fimA)のDNA塩基配列をもとにプライマーを設計した.各菌株より抽出した染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ,いずれの株からも約1.3kbのDNA断片が増幅された.このPCR産物を各種ベクターに組込み,E.coliDH5およびJM109株に形質転換した.ベクターと宿主の組み合わせで得られたクローンについてその発現量とクローンの安定性を比較した.その結果pUC19をベクターとして用いたり,宿主としてE.coliDH5株を用いた場合ではクローニングされたfimAは非常に不安定であった.低コピー数ベクターのpMW119を用いた場合安定ではあるが,発現量が非常に少なかった.発現のためにTrcプロモーターを持ち,同時にlacIリプレッサーを持つpTrc99と,宿主側にもlacIリプレッサーを持つE.coliJM109株との組み合わせが安定な発現を示したが,組換え線毛の発現量はあまり多くなかった.各菌株由来のfimAのDNA塩基配列をジデオキシ法で決定した.比較してみるとfimAのオープンリーディングフレームの上流および下流域では,ほとんど同一であったが,fimA部分では変化が見られ大きく4つのグループに分類できた.DNA塩基配列の解析によればfimAは大腸菌の典型的なプロモーター構造を上流に持たず,開始コドンも一般的なATGではなくGTGであり,これが組み換えタンパクの発現が弱い原因と考えられた.そこで開始コドンをATGに変換し,pTrc99のTrcプロモーター直後にfimAがつながるようプライマーを設計した.PCR産物をクローニングするとこのクローンでは多量の組換えタンパクの発現量が見られた.なお本研究で得られた各P.gingivalis fimA遺伝子のDNA塩基配列はDDBJDNA data bankにAccession No.D17794-D17802で登録した.

卟啉单胞菌是基于P. gingivalis381的FIMA基因的DNA碱基序列，ATCC33277，BH18/10，HW24D1，OMZ314，OMZ409，ATCC49417、6/26和HG564设计。当使用从每个菌株中提取的染色体DNA作为模板进行PCR时，从所有菌株中扩增了约1.3 kb的DNA片段。该PCR产品被整合到各种载体中。从载体和宿主组合获得的克隆转化为E. colidh5和JM109。比较了克隆的表达水平和稳定性。当使用PUC19用作载体或E. colidh5时，克隆的FIMA非常不稳定。尽管低拷贝数矢量PMW119稳定，但表达水平很小。它具有表达的TRC启动子，同时也是稳定的。 PTRC99与LACI抑制剂和Colijm109与LACI抑制剂的组合也存在稳定的表达，但重组菌毛的量不是很高。来自每个菌株的FIMA的DNA序列是通过二氧化法确定的。比较结果在FIMA开放阅读框的上游和下游区域几乎相同，但是更改了FIMA部分，从而可以将其分为四组。 DNA序列根据分析，FIMA没有大肠杆菌的典型启动子结构，并且起始密码子是GTG而不是常见的ATG，这被认为是重组蛋白表达弱的原因。因此，将起始密码子转换为ATG，并设计了底漆，以便在PTRC99的TRC启动子之后立即连接FIMA。克隆PCR产物时，在该克隆中观察到大量重组蛋白。此外，在这项研究中获得了每个牙龈疟原虫。 FIMA基因的DNA核苷酸序列使用登录号D17794-D17802在DDBJDNA数据库中注册。