S.mutansの付着に関わるグルカン合成酵素系の遺伝子工学的解析

参与变形链球菌附着的葡聚糖合酶系统的基因工程分析

基本信息

批准号：
06771584
负责人：
藤原卓
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

トランスポゾンTn1545由来のカナマイシン耐性遺伝子(kmr)をGTase-IをコードするgtfB遺伝子がクローニングされたプラスミドpSK6の中間に挿入し,S.mutansMT8148株に形質転換してallelic replacementによる挿入変異株を作製した.その結果コロニー形態の異なる3種類の形質転換株が分離された.サザンブロットを行ってkmrの挿入部位を調べたところ,コロニー形態がスムース型とラフ型の中間型を示すB29株はgtfBにkmrが挿入し,一方,親株,と同様のラフ型のB58株はgtfCにkmrが挿入していた.また,スムース型で親株よりもやや小さめのコロニーであるB32株はgtfBの後半部とgtfCの前半部が欠落し,その間にkmr遺伝子が挿入していることが明らかになった.これら変異株のGTaseの発現をウエスタンブロットで解析するとサザンブロットの結果を反映して,gtfBに挿入が起きたB29では菌体上に存在する156kdのGTase-Iの発現が認められず,一方gtfCに挿入が起きたB58株では菌体上に存在する145kdのGTase-SIの発現が認められなかった.gtfBとgtfCの両者間に挿入が起こっていたB32株ではGTase-I,GTase-SIどちらの発現も見られなかった.いずれのタイプのGTase欠失株も親株に比較して,スクロース依存性の付着能は有意に低下していた.付着率の低下は2種類のGTaseが欠失しているB32株が最も著しく,GTase-SI欠失のB58株,GTase-I欠失のB29株の順であった.これらの付着率の低下には各菌株間で統計学的に有意の差が認められた.この結果はGTase-Iに比較して,グルカン合成能が低いとされているGTase-SIが,粘着性のグルカンが合成されるのに特に重要な役割を果たしていることを示唆している.

来自转座子的TN1545的卡纳霉素抗性基因（KMR）被插入编码GTase-I的质粒PSK6中间，并转化为MutansMT8148菌株，转化为等位基因。通过替换产生插入突变株。结果，分离了三种具有不同集菌形态的转化菌株。当进行Southern印迹检查KMR的插入部位时，发现KMR的插入位点被发现插入B29的GTFB中，B29表现出平滑和粗糙类型之间的中间菌落形态，而与父母相似的粗糙B58菌株之间的中间菌落形态被插入GTFC中。另外，将平滑类型与母体菌株进行比较。发现B32菌株的菌落略微较小，其GTFB的后半部分缺失，而GTFC的前半部分，它们之间插入了KMR基因。当通过Western印迹分析这些突变体中的GTase表达时，Southern印迹的结果表明，在GTFB中插入的B29并未在细菌细胞上显示156KD GTase-I，而是插入GTFC中。具有诱导的B58菌株未显示细胞上存在145 kD的GTase-Si。 B32菌株在GTFB和GTFC之间插入，并未显示GTase-I或GTase-SI的表达。与母体菌株相比，两种GTase缺失菌株的蔗糖依赖性附着能力均显着降低。附着率的降低是由两种类型的GTase引起的。缺失菌株B32是最显着的，其次是带有GTase-SI缺失的B58应变和带有GTase-I缺失的B29菌株。固定率降低的菌株之间的统计学差异在统计上有显着差异。该结果表明，与GTase-I相比，GTase-Si在粘性葡萄糖的合成中起着特别重要的作用，据说GTase-SI具有较低的葡萄糖合成能力。