LA-PCR法を用いた効率的なリコンビナントGTaseの発現系の開発

利用LA-PCR方法开发高效重组GTase表达系统

基本信息

批准号：
08672364
负责人：
藤原卓
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672364/
关键词：
Streptococcus mutans グルコシルトランスフェラーゼ LA-PCR

项目摘要

Streptococcus mutans MT8148由来のGTase遺伝子gtfBとgtfCをもつ組換えプラスミドpSK6とpSK14をテンプレートとして用い,LA-PCR法によって約5kbの各gtf遺伝子の増幅を行った.この際,次のクローニングのために開始コドン部に制限酵素NcoIの切断部位を,カルポキシ末端部にはBglIIの切断部位が組み込まれるようにプライマーを設計した.ついでバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのプロモーターシステムをベースに,強力なプロモーターの制御機構を備えたpET-lldベクターに増幅したGTase遺伝子を組込み,gtfBを持つ組換えプラスミドpMT03及びgtfCを持つpMT01を作成した.これらを発現用の宿主大腸菌に形質転換後,IPTGを用いて誘導をかけ,リコンビナントタンパクを発現させた.このリコンビナントタンパクがGTaseであることを抗GTase抗体を用いてウエスタンブロットによって確認した.各種の発現用の宿主大腸菌を用いてGTase発現を検討したところHMS174(DE3)pLysE株が最も安定であった.さらに発現条件を検討したところIPTG濃度0.4mM,培養温度25℃が至適であった.また発現されたリコンビナントGTaseにグルカン合成能があるかを^<14>C-スクロースをもちいて調べたところ,有意の活性は認められるが,その活性は低コピーベクターpMW119にgtf遺伝子が組み込まれたpSK6やpSK14と比較して増加していなかった.これは発現されたリコンビナントタンパクが不溶化しているものと考えられるので尿素や界面活性剤を用いて可溶化を現在試みている.

使用重组质粒PSK6和PSK14的链球菌突变，它们从MT8148作为模板携带GTase基因GTFB和GTFC，每个GTF基因都通过LA-PCR扩增。在这种情况下，设计了一个底漆，以便在开始密码子上合并了限制酶NCOI的裂解位点，并在Calpoxy端将BGLII的裂解位点掺入了下一个克隆。然后将GTase基因基于噬菌体T7的启动子系统，将GTase基因整合到PET-LLD载体中，并创建重组质粒PMT03和GTFC。将它们转化为用于表达的宿主大肠杆菌，并使用IPTG表达重组蛋白。使用抗GTase抗体蛋白质印迹证实了这种重组蛋白。使用大肠杆菌（用于表达的宿主）研究GTase表达，HMS174（DE3）plyse菌株是最稳定的。此外，检查了表达条件，最佳IPTG浓度为0.4 mm，培养温度为25°C。当使用C-核糖群检查表达的重组GTase以确定表达的重组GTase是否具有葡萄糖合成能力时，发现其活性显着，但与PSK6和PSK14相比，它的活性并没有增加，而PSK6和PSK14的活性并没有增加，而PSK6和PSK14将GTF基因掺入了低点POPY PPECTOR PMW119中。人们认为这被表达的重组蛋白无法降低，因此目前正在尝试使用尿素或表面活性剂将其溶解。