RNA干渉による抗コクサッキーウイルス作用の検討

RNA干扰检测抗柯萨奇病毒效果

基本信息

批准号：
18659616
负责人：
藤原卓
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

コックサッキーウイルスは、小児において「ヘルパンギーナ」や「手足口病」の原因となるウイルスで、咽頭痛、口蓋部と咽頭における小水庖・小潰瘍の形成といった口腔症状もあることから、小児歯科領域においても遭遇する可能性の高い疾患である。その治療法は、抗ウイルス剤の投与が一般的であるが、対症療法にすぎず、特効薬は存在しない。そこで我々はRNA干渉によるウイルス抑制を試みてきた。さらに今年度はアンチセンス法に基づいたペプチド核酸(PNA)によるウイルスの増殖抑制実験を行った。RNAiではなく、PNAを利用する利点としては、(i)PNA/DNA、PNA/RNA間の結合力は、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA間の結合力よりも強い、(ii)PNAは天然に存在しない完全人工物質であるため、分解酵素などが存在しないということである。したがって、設計したアンチセンスPNAに抗ウイルス作用が観察されれば、RNAiよりも効果、投与法、保存法において優れた方法と考えられる。PNAの標的遺伝子は、(1)通常のRNAiで標的とされる領域、(2)VPg結合領域を選択し、これらの領域からセンス鎖、アンチセンス鎖の18塩基が抽出し、設計した。また、PNAの細胞内への取り込みは、cell penetrating peptideを修飾すると効率的であることが報告されており、この中でも最も効率が高いことが予想されるTat配列(GRKKRRQRRRPPQ-)を本研究では採用した。また、このペプチドとPNAの間には立体構造を維持するためにリンカー配列を2個付与した。上記の設計により作成されたアンチセンスPNAをコックサッキーウイルス感染細胞に投与し、プラークアッセーにより、抗ウイルス増殖作用を検討した。その結果、RNAi標的領域ではセンス鎖、アンチセンス鎖ともにほとんどウイルスの増殖が認められなかったが、VPg結合領域のアンチセンス鎖では若干のウイルス増殖抑制効果が認められた。今後は投与条件をさらに検討するとともに、RNAポリメラーゼのコード領域等も含め設計し、単独あるいは組み合わせによるウイルス増殖抑制効果も検討する予定である。

Cocksackie病毒是一种病毒，会引起赫普吉纳和手，脚和口腔疾病的儿童，并且是一种疾病，可能在儿科牙科领域遇到，因为它还具有口腔症状，例如喉咙痛和pa骨和咽部小溃疡的形成。该治疗通常由抗病毒剂进行，但仅是一种症状治疗，没有治愈方法。因此，我们试图通过RNA干扰抑制病毒。此外，今年我们基于反义方法进行了一项实验，使用肽核酸（PNA）抑制病毒的生长。使用PNA而不是RNAI的优点是（i）PNA/DNA和PNA/RNA之间的结合力比DNA/DNA，DNA/RNA和RNA/RNA和RNA/RNA和（ii）PNA之间的结合力更强，而PNA是完全人为的药物，并不是自然发生的，因此没有脱脂剂。因此，如果在设计的反义PNA中观察到抗病毒作用，则认为它是一种优秀的有效性，给药和储存方法，而不是RNAi。选择PNA的靶基因（1）由正常RNAi靶向的区域，（2）VPG结合区域，从这些区域中提取并设计了18个理性链和反义链的碱基。此外，据报道，在修饰细胞穿透性肽时，PNA摄取对细胞的摄取效率是有效的，并且预计将是最有效的TAT序列（GrkKrRQRRPPQ-）。另外，分配了两个接头序列，以维持该肽和PNA之间的空间结构。通过上述设计产生的反义PNA对感染的CockSackievievirus细胞进行了施用，并通过牙菌斑测定研究了抗病毒增殖作用。结果，尽管在RNAi靶区域的感官链和反义链中观察到很少的病毒增殖，但VPG结合区域中的反义链显示出抑制病毒生长的轻微作用。将来，我们将进一步考虑给药条件，并设计RNA聚合酶的编码区域，并讨论单独或组合抑制病毒生长的效果。