UDP-ガラクトース:セラミドガラクトース転移酵素のcDNAクローニング

UDP-半乳糖:神经酰胺半乳糖基转移酶的 cDNA 克隆

• 批准号: 05780448
• 负责人: 小倉 潔
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780448/
• 关键词: ガラクトシルセラミド; 発現クローニング; パンニング

今年度、ガラクトシルセラミド合成酵素のcDNA発現クローニングを目指し、以下の実験を進め以下の結果を得た。1.cDNAライブラリーの作製,動物細胞発現ベクター(pME18S)を用いてガラクトシルセラミドを多量に発現しているラット脳のcDNAライブラリーを作製した。2.発現クローニング(1)宿主細胞にcDNAライブラリーを形質導入、(2)抗ガラクトシルセラミド抗体を用いたパンニング法でガラクトシルセラミド陽性細胞を選択、(3)プラスミドをHirt法による回収および大量調整、(1')調整プラスミドをCOS細胞に形質導入、(4)(1')(3)を4サイクルを行いガラクトシルセラミド合成酵素のcDNAを濃縮した。4サイクル後のプラスミドをCOS細胞とメラノーマ細胞にトンスフェクションし、FACS分析を行った。両細胞共に数%の強陽性細胞が認められ、GalCer合成に関連する蛋白のcDNAが濃縮されていると考えた。(5)そこで、4サイクル後のベクター由来シングルコロニーを100個ずつにグループ小分けし、各グループのプラスミドをCOS細胞にトランスフェクション・FACS分析を行い、4グループ中3グループに有為のシフトが認められた。その中で最も陽性細胞の多いグループの100シングルプラスミドを個々に調整し、それらを再度COS細胞とメラノーマ細胞にトンスフェクション・FACS分析を行い、約3Kbpのインサートを持つクローンp34A34をガラクトシルセラミド合成に関連する蛋白のcDNAを含むプラスミドとしてクローニングした。3.塩基配列決定 このp34A34のインサートの塩基配列をプライマー移動法を用いて決定した。このインサートは2.8kbpからなり、696アミノ酸をコードした一つのORFを含んでいた。4.現在さらに分析を進めている。

This year, the results show that the synthetic enzymes cDNA show significant improvement. The following results show that the results are satisfactory. The 1.cDNA will cause a lot of trouble, and the animal cell will be able to use the pME18S to tell you how much you need to know. You will need to know how much you can do. You will need to know if you have a cDNA problem. two。 The results show that: (1) the host cell (1) contains a large number of cDNA cells, (2) the anti-virus antibody is detected in the host cell, (2) the anti-virus antibody is detected in the host cell, (2) the host cell (1), the host cell ( (4) (1') (3) 4-month-old cDNA enzyme was used as synthetic enzyme. 4. In the end, the COS cell was analyzed and the FACS analysis was performed. The total number of cells was%. The number of strong cells was not detected. The protein was synthesized by GalCer. The protein was detected by cDNA. (5) the reason for this is that after the first half of the year, the number of COS cells in each bank is very close to that of FACS analysis, and that of 3 per cent of each month is the same as that of each other. The most important thing in the world is that there is no difference in the number of cells in the market. In this case, the most important thing in the world is that the two cells are adjusted, and the COS cells are analyzed again. The FACS analysis line is divided into two parts: the cell cycle, the FACS analysis line, the p34A34 template, the synthetic protein, the cDNA protein, the protein. 3. Base column determination p34A34 column selection method is used to determine the base configuration. Please tell me that there are some problems in the 2.8kbp. You may find that the ORF contains a small amount of acid. 4. We are now in the process of analyzing the situation.