Ο-アセチル-ガングリオシド合成酵素cDNAのクローニング

Ο-乙酰基神经节苷脂合酶 cDNA 的克隆

• 批准号: 07780522
• 负责人: 小倉 潔
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780522/
• 关键词: ガングリオシド; cDNA; クローニング; Ο-アセチル基

ラット脳由来の動物細胞発現ベクターcDNAライブラリーを発現クローニングのホスト細胞として作製したCHOST細胞に遺伝子導入した。3日後、Ο-Ac-GD3ガングリオシドを発現した細胞をフローサイトメターを用いてソーティングし、その中のΟ-Ac-GD3ガングリオシド発現に関与するcDNAを含むプラスミドを回収した。この操作を繰り返し、目的とするcDNAを含むプラスミドを濃縮した。さらに、シブ-セレクションを行い、プラスミドを小グループに分けてフローサイトメター分析行い、Ο-Ac-GD3ガングリオシド合成に関与すると考えられるcDNA(33H4)を単離した。その33Hを遺伝子導入したCHOST細胞は、抗Ο-Ac-GD3モノクロナル抗体を用いたFACSでは有意に高蛍光領域にシフトした。また、その細胞でのΟ-Ac-GD3ガングリオシドの発現を抗Ο-Ac-GD3モノクロナル抗体を用いたTLC-イムノステイニングによって確認した。さらに、33H4を遺伝子導入したCHOST細胞抽出液に^<14>C-Ac-CoAを加えることにより、^<14>C-Ο-Ac-GD3ガングリオシドが生成することを確かめた。以上の結果からこのcDNA(33H4)がコードしている蛋白がΟ-Ac-GD3ガングリオシドの発現に関与しているΟ-アセチル-ガングリオシド合成酵素と考え,33H4をラットΟ-アセチル-ガングリオシド合成酵素(ratΟ-AcetylGanglioside Synthase(rAGS))と名付けた。塩基配列の解析から、rAGSには427アミノ酸をコードする1つのORFが存在し、そこにはN-末端に疎水性の膜貫通ドメインを持つタイプII型と推定される分子量約47KDaの蛋白がコードされていることが明らかとなった。

The gene expression system of CHOST cells was introduced into animal cells. Three days later, the cDNA of the 3-Ac-GD-3 gene was recovered from the cells and used in the study. This is the first time I've ever seen a human. In addition, the cDNA(33H4) was isolated from the cDNA library by using the cDNA library, the cDNA library, and the cDNA library. 33H gene expression vector was introduced into CHOST cells and anti-Ac3 antibody was used in FACS. The detection of anti-Ac-GD3 antibodies in cells was confirmed by TLC-MS. 33H4 gene was introduced into CHOST cell extract, and the production of <14>C-Ac-CoA and C-Ac<14>-GD3 was confirmed. The results showed that the cDNA(33H4) was related to the development of O-AcGD3-GD3-G A protein with a molecular weight of approximately 47KDa was identified by analysis of the nucleotide sequence, rAGS, and N-terminal amino acid sequence.