ニューロフィラメントにおける糖鎖付加修飾の機能的意義の解析

神经丝糖基化的功能意义分析

基本信息

批准号：
06770098
负责人：
顧建国
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770098/
关键词：
神経細胞線維細胞骨格蛋白リン酸化糖蛋白質質量分析

项目摘要

神経細胞の骨格蛋白である神経細胞線維(neurofilament以下NF)のリン酸化はNFの機能発現に必須なNF群のアセンブリーに関わり、また筋萎縮性側索硬化症(以下ALS)その他の神経疾患において異常なリン酸化が報告されていることから、近年特に注目を集めている。本研究では部位特異的リン酸化およびそれに関わる可能性のある糖鎖付加修飾を解析するための方法論を確率するために、まずウシNF-Lのクローニングおよびアミノ酸配列を決定した。その結果ウシではtail domain内に合計12残基のAla-Glu反復配列があり、そのためにすでに報告されている他の哺乳動物種に比べて最も長いアミノ酸長であった。また、NF-Lでは初めてN末端アセチル化を同定した。次に、いずれの哺乳類NF-Lにおいても保存されているtail domain内Ser473のリン酸を調べるため、ウシの脊髄よりフォスファターゼ阻害剤存在下において常法に従ってNF-Lを精製したのち、臭化シアンによる化学的切断および酵素消化によりtail domainを得、このポリペプチドに対してエレクトロプレイイオン化質量分析・キャピラリー電気泳動分析を行なうことによってこのSer残基のリン酸化の割合を70%と決定した。大脳より精製したNF-Lについても同様の解析を行なったがリン酸化の割合は同程度であって。これは以前にラットにおいて報告されていた値と同程度であり、NF-Lが生体内で他の分子と構造体を形成し機能を発揮する上でリン酸化分子と非リン酸化分子がともに必要であるのかも知れない。NF-Lには0-GlcNAcの存在が報告されているが、本研究ではウシNF-Lを材料として、メタ過ヨウ素酸酸化後にヒドラジドを結合させる糖検出系(Glycan Detection Kitによる)、レクチンによる分析、さらにピリジルアミノ化ラベル法に基づいた糖組成分析などを行ない、0-結合型糖鎖の他にN-結合型糖鎖の存在を示唆するデータを得たが、確証を得るには至らなかった。

神经元纤维（神经丝低于神经丝）的磷酸化是一种神经元的骨骼蛋白，近年来一直引起人们的特别关注，因为它参与了NFS的NF组组装，并且据报道异常磷酸化，据报道，疗法磷酸化异常磷酸化。在这项研究中，首先确定牛NF-L的克隆和氨基酸序列，以安排分析位点特异性磷酸化和可能的糖基化修饰的方法。结果，牛在尾部结构域中共有12个残基，这就是为什么与已经报道的其他哺乳动物物种相比，它是最长的氨基酸长度的原因。此外，在NF-L中首次鉴定出N端乙酰化。接下来，为了在所有哺乳动物NF-L中检查Ser473在尾部结构域中的磷酸盐，NF-L在常规方法的存在下从牛脊髓中纯化了NF-L，然后根据常规方法，然后通过使用氰基溴化物溴化物和enzyzymide和enzyzymidatic retestion获得尾部结构域。对多肽进行电离电离质谱法和毛细管电泳分析，以确定该Ser残基的磷酸化为70％。对从大脑纯化的NF-L进行了类似的分析，但磷酸化速率大约相同。这与先前在大鼠中报道的水平大致相同，并且可能是NF-L需要磷酸化和非磷酸化的分子与其他分子形成结构并在体内发挥其功能。尽管在NF-L中已经报道了0-GLCNAC的存在，但在这项研究中，使用牛NF-L作为材料，一种糖检测系统（通过Glycan检测试剂盒）结合了在Metaperiodic酸氧化，凝集蛋白分析和基于基于吡啶基氨基化的糖的糖的糖分的糖组成的糖组成的糖分分析后，糖组成分析的糖组成的糖分，糖的糖分不足，糖的糖固定量为n固定的糖固定，糖的成分是固定的，糖的成分是N not n Noke n n n n Notin获得了确认。