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ニューロフィラメントにおける糖鎖付加修飾の機能的意義の解析

神经丝糖基化的功能意义分析

基本信息

批准号：
06770098
负责人：
顧建国
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770098/
关键词：
神経細胞線維細胞骨格蛋白リン酸化糖蛋白質質量分析

项目摘要

神経細胞の骨格蛋白である神経細胞線維(neurofilament以下NF)のリン酸化はNFの機能発現に必須なNF群のアセンブリーに関わり、また筋萎縮性側索硬化症(以下ALS)その他の神経疾患において異常なリン酸化が報告されていることから、近年特に注目を集めている。本研究では部位特異的リン酸化およびそれに関わる可能性のある糖鎖付加修飾を解析するための方法論を確率するために、まずウシNF-Lのクローニングおよびアミノ酸配列を決定した。その結果ウシではtail domain内に合計12残基のAla-Glu反復配列があり、そのためにすでに報告されている他の哺乳動物種に比べて最も長いアミノ酸長であった。また、NF-Lでは初めてN末端アセチル化を同定した。次に、いずれの哺乳類NF-Lにおいても保存されているtail domain内Ser473のリン酸を調べるため、ウシの脊髄よりフォスファターゼ阻害剤存在下において常法に従ってNF-Lを精製したのち、臭化シアンによる化学的切断および酵素消化によりtail domainを得、このポリペプチドに対してエレクトロプレイイオン化質量分析・キャピラリー電気泳動分析を行なうことによってこのSer残基のリン酸化の割合を70%と決定した。大脳より精製したNF-Lについても同様の解析を行なったがリン酸化の割合は同程度であって。これは以前にラットにおいて報告されていた値と同程度であり、NF-Lが生体内で他の分子と構造体を形成し機能を発揮する上でリン酸化分子と非リン酸化分子がともに必要であるのかも知れない。NF-Lには0-GlcNAcの存在が報告されているが、本研究ではウシNF-Lを材料として、メタ過ヨウ素酸酸化後にヒドラジドを結合させる糖検出系(Glycan Detection Kitによる)、レクチンによる分析、さらにピリジルアミノ化ラベル法に基づいた糖組成分析などを行ない、0-結合型糖鎖の他にN-結合型糖鎖の存在を示唆するデータを得たが、確証を得るには至らなかった。

The expression of neurofilament (NF) in neurons is essential for the functional development of NF, which is associated with atrophic lateral sclerosis (ALS) and other neurological disorders. This study was conducted to determine the possibility of site-specific acidification and modification of NF-L and its methodological accuracy. As a result, the total number of residues in the tail domain was 12, and the length of Ala-Glu in other mammalian species was longer than that in the tail domain. NF-L In the presence of a chemical inhibitor, NF-L is purified by chemical cleavage and enzyme digestion in the tail domain. 70% determination of the cleavage of Ser residues by mass analysis and electrokinetic analysis The NF-L is highly refined and the same analysis is performed, but the degree of separation and integration of acidification is different. This is the first time that NF-L has been reported to be able to form and function other molecular constructs in vivo. The existence of NF-L and 0-GlcNAc was reported in this study. In this study, NF-L was used as a material to synthesize NF-L.(Glycan Detection Kit), Crucial Analysis, and Chemical Analysis of Carbohydrate Composition in the Base, 0-Conjugated Carbohydrate Lock and Other N-Conjugated Carbohydrate Lock.