权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

急速凍結装置の改良とそれを基本とした高精度の免疫組織化学法の開発およびその応用

快速冷冻设备的改进及基于其的高精度免疫组化方法的开发及其应用

基本信息

批准号：
07557181
负责人：
片山栄作
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至 1996
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、種々の生理的状態の組織や細胞を液体ヘリウムによる急速凍結とそれに続く凍結置換法またはディープエッチレプリカ法を用いて処理し、それぞれ状態における色々な細胞内蛋白質成分の静的な局在部位やそれらの部位の移動を、免疫組織化学的手法を用いて調べる技術を開発することを目的として開始した。実際には、1)急速凍結技術自体の良好な凍結部位の深度を上げること、2)そして凍結置換後に樹脂包埋・薄切した試料中の抗原を蛍光標識しその局在を示す微弱なシグナルを高感度・高分解能の冷却CCDカメラによって捉えることなどに努力した。1)に関しては、フリージングヘッド部分を熱伝導率の低い材質に変えたときにやや結果が良いようであった。2)では、哺乳動物小脳のプルキンエ細胞におけるイノシトール3燐酸受容体(IP_3R)の分布を調べるべく、急速凍結後フォルマリン・アセトンにより凍結置換を行い樹脂包埋後の超薄切片を抗IP_3R抗体で標識した。この切片は、電子顕微鏡観察に使う厚さに近く、抗体染色は辛うじて肉眼的に認められる程度のごく弱いものであったが、冷却CCDにより撮影したプルキンエ細胞はその細胞体・樹状突起ともに多数の点状の像を明瞭に示し、多くの場合数個の点が直線状に並んで分布していた。同時に作製した切片の電子顕微鏡像からこれらの点状の構造物が滑面小胞体であることが判明したが、同じ材料のフリーズレプリカ像において、相当する部位に2次元結晶を形成する膜蛋白質が検出され、さまざまな証拠からこの成分がIP_3Rであることを確認した。次に、植物細胞において約70μm/secという高速の原形質運動を担うミオシン分子の局在部位を探索した。細胞を開いて筋肉ミオシンSlを潅流後急速凍結してそのレプリカを観察するとSlで修飾されたアクチン束の一部が小胞体からの突出物に結合していた。この分子は尾部に球状ドメインを有し、そこで膜に結合しているらしい。

This study is aimed at developing techniques for rapid freezing, rapid freezing and displacement of cellular proteins in physiological state, color change, and localization of cellular proteins, as well as for immunohistochemical techniques. In this case, 1) the rapid freezing technique increases the depth of the good frozen part itself; 2) after the freezing replacement, the antigen in the resin embedded, thin-cut sample is labeled by fluorescence; 3) the local area is indicated by weak detection; 4) the cooling CCD with high sensitivity and high decomposition energy is detected. 1) The results of this study are as follows: 2) The distribution of IP_3R in mammalian cells was modulated and identified by anti-IP_3R antibody in ultra-thin sections after rapid freezing. The sections were examined by electron microscopy, and the antibody staining was performed in a thick and thin manner. The images were detected by a cooled CCD, and the cell bodies, dendrites, and a plurality of dots were detected. At the same time, the electron micro-mirror image of the slice was prepared, and the dot structure and the small cell of the sliding surface were identified. The protein of the film was detected and the component of the film was identified. In addition, the plant cell temperature is about 70μm/sec, and the protoplast movement at high speed is required to explore the molecular structure. The cells are rapidly frozen after they are opened, and a portion of the cells are attached to the protrusions. The molecules are spherical in shape and bound together in a membrane.