肝癌特異的に発現するGST-Pの転写因子GPEI結合因子の精製及びcDNAの単離

肝癌特异性表达的GST-P转录因子GPEI结合因子的纯化及cDNA分离

• 批准号: 07770111
• 负责人: 久武 幸司
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770111/
• 关键词: 肝癌; GST-P; 転写因子

われわれは、GPEIに結合する因子の解析を行い、肝癌細胞AH66と正常肝で比較検討したところ複数の因子がGPEIに結合することを見いだした。フットプリント法の結果より、1)GPEIのTRE-like配列に結合する因子、2)GPEIのTRE-like配列の20-50bp上流に結合する複数の因子を同定した。1)の因子は肝癌と正常肝でフットプリント上では差が認められないが、2)の因子は両者の間でフットプリント上で明らかな差が認められる。1)の因子はさらにDEAE-Sepharoseに結合するものとそうでないものに分かれる。これらの結果、GPEIに結合する因子は少なくとも4種類はあることが明らかとなった。我々の目的とする因子を同定するためには、それぞれの因子がGST-Pの転写活性化に関与しているかを明らかにする必要がある。まず、これらの因子の精製を進めるために、GST-Pを高発現しているAH66細胞をラット腹腔内で培養し、ラット120匹より600mlの核抽出液を調製した。次に、それぞれの因子を分離するために、幾つかのカラムクロマトグラフィーでの結合活性の挙動を検討した。我々の同定した因子の多くは、陰イオン交換樹脂とヘパリンに結合し、これらを用いて部分精製できることが明らかになった。さらに、このように分離した因子の転写活性を調べるために、ラット正常肝より再構成in vitro転写系を構築中である。基本転写因子は、組み換え体TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIAを大腸菌またはバキュロウイルスの系を用いて精製した。現在これら以外の因子(Pol II,TFIIH,TFIID)をラット肝より精製しており、これらを用いることによって、精製した各の転写活性を検討することができる。

Analysis of GPEI binding factors in liver cancer cells AH66 and normal liver cells The results of this method are as follows: 1) the binding factor for TRE-like alignment of GPEI; 2) the binding factor for 20-50bp upstream of TRE-like alignment of GPEI. 1) the factor of liver cancer and normal liver, 2) the factor of liver cancer and normal liver. 1) The reason for this is that the DEAE-Sepharose junction is not separated. The result of this is that the GPEI factor is less than 4. The purpose of this study is to determine whether or not the factors involved in GST-P activation are necessary. AH66 cells were cultured intraperitoneally and prepared with 600ml nuclear extract at 120 rpm. In the second place, the factors of separation, separation and binding activity are discussed. There are many factors that determine our identity. The combination of anionic exchange resin and resin can be used to partially refine it. In addition, the separation factor and the writing activity are regulated, and the normal liver is reconstructed in vitro writing system construction. The basic writing factors are used to refine the system of TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIA coli Now the factors (Pol II,TFIIH,TFIID) are refined, used, refined, and each activity is discussed.