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X線構造解析に基づくサイクロデキストリン合成酵素の環形成反応の解析と応用

基于X射线结构分析的环糊精合成酶成环反应分析及应用

基本信息

批准号：
08660088
负责人：
山根國男
金额：
$ 1.22万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

好アルカリ性Bacillus sp.♯1011のサイクロデキストリン合成酵素(CGTase)の遺伝子をクローン化し、大腸菌に導入し、発現させた後、精製・結晶化し、1。8Aの解像度での立体構造解析に成功した。そこで本酵素の活性中心を形成しているアミノ酸残基、アミラーゼと共通するアミノ酸残基などを遺伝子工学的手法で別のアミノ酸に置換した変異CGTaseを構築し、結晶を作成し、解析した。いずれの酵素の場合も1格子当り2分子のCGTaseが含まれていた。また阻害剤アカボ-ス、基質マルトースなどとCo-crystallizationさせることにも成功した。サブタイトS-2' を形成するPhe183とPhe259をそれぞれ同時にLeuに置換したF183L/F259L変異酵素では不均化反応は野性型酵素の93%も保存されているにもかかわらず、β-サイクロデキストリンを精製する環形成反応が0。5%にまで低下していた。またこの変異酵素のアカボ-スによる阻害活性(ID50)は10、000倍も高くなり、アカボ-スの阻害効果はほとんど無くなっていることが分かった。野性型CGTaseとアカボ-スのコンプレックスと変異CGTaseとアカボ-スのコプレックスの立体構造を比較したところ、アカボ-スの結合部位が両者で全く異なっており、変異酵素ではアカボ-スが触媒残基周辺から離れて結合していることが分かった。この結果は3KB-G5CNPを基質にした際の切断点の変化と一致していた。一方この変異酵素によって生成されるサイクロデキストリンは野性型酵素と同様にβ型が主生産物であった。

Good Bacillus sp. 1011. The synthetic enzyme (CGTase) was digested, the bacteria were introduced, and the sperm was crystallized after it was detected. 8A "resolution", "stereo" analysis "success". The active center of this enzyme was formed by the formation of acid residues, acid residues and acid residues. When the enzyme is in the lattice of 1, the CGTase of 2 molecules contains the enzyme. To prevent the success of Co-crystallization, to prevent the loss of success. The effect of Leu on the formation of Phe183 Phe259 enzyme was studied. At the same time, the enzyme homogenization of F183L/F259L enzyme was not homogenized and the wild-type enzyme was not homogenized. 5% of the time is low. The enzyme inhibition activity (ID50) was 10, 000 times higher than that of the control group. In the wild type of CGTasevirus, there were three-dimensional tests in which the CGTase residues were isolated, and the combination sites of the wild-type CGTasevirus and the combined parts of the wild type CGTaseGASE were isolated from the whole body, the enzyme was isolated and the catalyst residue was isolated. The results show that the 3KB-G5CNP cut-off points are consistent. One side is responsible for the production of wild-type enzymes that are the same as the β-type enzymes.