超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

创造用于超精确分子识别的新一代抗体

• 批准号: 10145202
• 负责人: 後藤 順一
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145202/
• 关键词: 非競合型イムノアッセイ; 抗イディオタイプ抗体; モノクローナル抗体; ハプテン; 胆汁酸代謝物; 抗メタタイプ抗体; 人工抗体

低分子生理活性分子に対する抗ハブテン抗体は、抗体調製時の感作抗原がキャリアープロテインとの複合体であるため、親和定数(Ka)の最大値が10^<12>M^<-1>と低く、分子認識能に乏しい。そこで、まずモノクローナル「抗メタタイプ抗体」及び「抗イディオタイプ抗体」を作製するとともに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換し、生体のレパートリーにはみられない一次構造を有する「人工抗体(超抗体)」のライブラリーを構築し、これによりハプテン抗原に対してきわめて高い特異性と親和力を持つ超抗体の作製を試みた。抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製抗イディオタイプ抗体と抗メタタイプ抗体を同時に調製するために、そのパラトープをハプテンでアフィニティーラベルした第一抗体で免疫するのが効果的である。そこで、先に調製したモノクローナル抗ウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA7-NAG)抗体にUDCA7-NAG N-succinimidyl esterを反応させたのちヘモシアニンとの結合体としてA/Jマウスに反復投与した。その脾細胞をP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合し、HAT選択培養を経て6種の抗イディオタイプ抗体産生株を樹立した。その結果、2種(Ab2一44、Ab2-45)は第一抗体のパラトープを認識するβタイプ抗イディオタイプ抗体であり、他の4種は、フレームワーク領域を認識するαタイプ抗体と推定された。そこで、αタイプ抗体Ab2-19とβタイプ抗体Ab2-45を組み合わせて、標識ストレプトアビジンを用いる非競合型idiometric assayを試みたところ、高感度な用量作用曲線(検出限界:500fg)を得ることができた。超抗体の創製モノクローナル抗11-デオキシコルチゾール(S)抗体産生株から全RNAを分離し、RT-PCR法によりV_H及びV_LドメインのDNAを増幅した。両者をPCRスプライシングにより連結すると同時にリンカー配列(Gly_4Ser)_3を導入しscF_V遺伝子(5'V_H-linker-V_L3')を構築した。これをファージディスプレイベクター(pEXmide5)に挿入したのち大腸菌XL1-Blue株に導入し、ヘルパーファージを感染させてファージ抗体を調製した。次いでこのクローン化したscF_V遺伝子をPCRにより増幅するとともに、その3'末端にHis6 tag及びオーカーコドンを付加した。これをpEXmide5ベクターに挿入し、大腸菌XL1-Blue株に発現させて、可溶型scF_Vをペリプラズム抽出物として得た。本scF_Vの親和力、特異性をトリチウム標識Sを用いるRIAにより検討したところ、対応する天然型モノクローナル抗S抗体(MAb)の性質を十分に保持しており、しかも親和定数が1.3x10^<10>M^<-1>と極めて高いことが判明した。

Low molecular biological active molecules に す seaborne る resistance ハ ブ テ ン の feeling when antibodies は, modulation as antigen が キ ャ リ ア ー プ ロ テ イ ン と の complex で あ る た め, affinity constant (Ka) の nt biggest が 10 ^ < 12 > M ^ < 1 > low と く, molecular recognition can に spent し い. そ こ で, ま ず モ ノ ク ロ ー ナ ル "anti メ タ タ イ プ antibody" and び "anti イ デ ィ オ タ イ プ antibody" を cropping す る と と も に, but 伝 レ ベ ル で antibody molecules の phase filling property field (CDR) の ア ミ ノ acid with column を ラ ン ダ ム に variations in し, body の レ パ ー ト リ ー に は み ら れ な い once tectonic を す る "artificial antibodies (super resistance Body) "の ラ イ ブ ラ リ ー を constructing し, こ れ に よ り ハ プ テ ン antigen に し seaborne て き わ め て high い specificity と を hold つ affinity antibodies の cropping を try み た. Resistance メ タ タ イ プ and び resistance イ デ ィ オ タ イ プ antibody の created resistance イ デ ィ オ タ イ プ antibody と resistance メ タ タ イ プ antibody を に modulation at the same time す る た め に, そ の パ ラ ト ー プ を ハ プ テ ン で ア フ ィ ニ テ ィ ー ラ ベ ル し で た first antibody immune す る の が unseen fruit で あ る. そ こ で, first に modulation し た モ ノ ク ロ ー ナ ル resistance ウ ル ソ デ オ キ シ コ ー ル acid 7 - N - ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ニ ド (UDCA7 - NAG) antibody に UDCA7 - NAG N succinimidyl. - esterを inverse 応させた ちヘモシアニ ちヘモシアニ と と と combination と て てA/J ウスに ウスに is repeatedly thrown to た た. そ の spleen cells を P3 / NS1/1 - Ag4-1 ミ エ ロ ー し と マ cell fusion, HAT, sentaku cultivate を 経 て six の resistance イ デ ィ オ タ イ プ antibody generation plants を set し た. そ の results, two (Ab2 a 44, Ab2-45) the first antibody の は パ ラ ト ー プ を know す る beta タ イ プ resistance イ デ ィ オ タ イ プ antibody で あ り, he の four は, フ レ ー ム ワ ー ク field を know す る alpha タ イ プ antibody と presumption さ れ た. Ab2 そ こ で, alpha タ イ プ antibody - 19 と beta タ イ プ antibody Ab2-45 を group み close わ せ て, identifies ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン を with い る non competition idiometric assay を try み た と こ ろ, Gao Gan な dosage effect curve (検 limit: 500 fg) を る こ と が で き た. Super antibody の created モ ノ ク ロ ー ナ ル 11 - resistant デ オ キ シ コ ル チ ゾ ー ル (S) antibodies produce strain か ら RNA を separation し, rt-pcr method に よ り V_H and び V_L ド メ イ ン の DNA を rights of し た. Who struck を PCR ス プ ラ イ シ ン グ に よ り link す る と simultaneously に リ ン カ ー match column (Gly_4Ser) _3 を import し scF_V heritage 伝 son (5 'V_H - would - V_L3) を build し た. こ れ を フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ ベ ク タ ー (pEXmide5) に scions into し た の ち coliform XL1 - Blue plant に import し, ヘ ル パ ー フ ァ ー ジ を infection さ せ て フ ァ ー ジ antibody を modulation し た. Time い で こ の ク ロ ー ン change し た scF_V posthumous son 伝 を PCR に よ り rights of す る と と も に, そ の 3 'end に His6 tag and び オ ー カ ー コ ド ン を plus し た. こ れ を pEXmide5 ベ ク タ ー に scions into し, coliform XL1 - Blue strains に 発 now さ せ て, soluble scF_V を ペ リ プ ラ ズ ム extract と し て た. This scF_V の affinity and specificity を ト リ チ ウ ム logo S を with い る RIA に よ り beg し 検 た と こ ろ, 応 seaborne す る type natural モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody (MAb) against S の nature を very に keep し て お り, し か も affinity constant が 1.3 x10 ^ < > 10 M ^ < 1 > と め extremely high て い こ と が.at し た.

项目成果

Junichi Goto: "Separation and characterization of carboxyl-linked glucuronides of bile acids in incubation mixture of rat liver microsomes" Steroids. 63. 186-192 (1998)

Junichi Goto：“大鼠肝微粒体孵育混合物中胆汁酸羧基连接的葡萄糖苷酸的分离和表征”类固醇。

Shigeo Ikegawa: "Separatory determination of diastereomeric ibuprofen glucuronides in human urine by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry" Biomed.Chromatogr.12. 317-321 (1998)

Shigeo Ikekawa：“通过液相色谱/电喷雾电离质谱法分离测定人尿液中的非对映异构体布洛芬葡萄糖醛酸”Biomed.Chromatogr.12。

Shigeo Ikegawa: "Covalent binding of bile acid acyl glucuronide with protein" Anal.Sci.(in press).

Shigeo Ikekawa：“胆汁酸酰基葡萄糖醛酸与蛋白质的共价结合”Anal.Sci.（出版中）。

Norihiro Kobayashi: "Production and characterization of group-specific monoclonal antibodies recognizing non amidated glycine-and taurine-amidated ursodeoxycholic acid 7-N-acetyl glucosaminides" J.Steroid Biochem.Molec.Biol.64. 171-177 (1998)

Norihiro Kobayashi：“识别非酰胺化甘氨酸和牛磺酸酰胺化熊去氧胆酸 7-N-乙酰氨基葡萄糖的组特异性单克隆抗体的生产和表征”J.Steroid Biochem.Molec.Biol.64。

Shigeo Ikegawa: "Characterization of cholyl-adenylate in rat microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry" Anal.Biochem.266. 125-132 (1999)

Shigeo Ikekawa：“通过液相色谱/电喷雾电离质谱法表征大鼠微粒体中的胆酰腺苷酸”Anal.Biochem.266。