新世代抗体を活用する内分泌撹乱物質のハイスループットスクリーニングシステム

使用新一代抗体的内分泌干扰物高通量筛选系统

• 批准号: 14042204
• 负责人: 後藤 順一
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14042204/
• 关键词: 内分泌撹乱物質; ハイスループット; スクリーニング; エストラジオール; 抗体; 遺伝子クローニング; 相補性決定部; CDRシャッフリング; ハプテン; モノクローナル抗体; ELISA

環境中女性ホルモン様物質の影響を精査するために、エストラジオール(E_2)のハイスループットスクリーニング法が切望され、高親和力で特異的な抗体が求められている。野生型抗体の相補性決定部(CDR)にランダム変異を導入することにより高性能な改変抗体の創製が可能と期待される。そこで、error-prone PCRにより得られる変異CDR遺伝子断片を野生型抗体のフレームワーク(FR)遺伝子にランダムに組み込む"CDRシャッフリング"に基づく変異抗E_2抗体の創製を企てた。先に樹立した抗E_2抗体産生ハイブリドーマ株よりRNAを単離し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖可変部(V_H,V_L)遺伝子をクローニングした。これらを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)の遺伝子を構築し、その産物である野生型scFvを用いて競合ELISAを行った結果、遊離E_2添加量2-200ngにおいて用量作用曲線が得られた。本scFv遺伝子を鋳型として0.5又は1.0mM MnCl_2存在下でerror-prone PCRを行い、変異クローン27種のV_H及びV_L塩基配列を解析したところ、最大13%の高い効率で点変異の導入が認められた。その一方で、V_H、V_L各ドメインに対応する遺伝子の全長をそれぞれ6本の一本鎖合成オリゴDNA(5'側から#1〜#6;およそ60〜120merの範囲)に分解し,これをrecursive PCRに付すことで元のscFv遺伝子が再構成されることを確認した。得られた変異scFv遺伝子群のCDR部分をPCRにより増幅することで、変異CDR遺伝子断片群(#2、3、5に相当)を調製することができる。これらを野生型FR遺伝子断片(#1、#4、#6に相当)と混合してrecursive PCRに付すことで得られるCDRシャッフリングライブラリーから、親和力と特異性に優れる変異抗体の探索が可能と期待される。

Environment women ホ ル モ ン others material の influence を accuracy check す る た め に, エ ス ト ラ ジ オ ー ル (E_2) の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ method が eager さ れ, high affinity で specific antibody が な め ら れ て い る. Wild type filling property department (CDR) antibody の phase に ラ ン ダ ム - different を import す る こ と に よ り high-performance な might change - antibody の created が と expect さ れ る. そ こ で, error prone PCR に よ り have ら れ る - different traces of CDR 伝 son fragment を wild type antibody の フ レ ー ム ワ ー ク (FR) posthumous son 伝 に ラ ン ダ ム に group み 込 む "CDR シ ャ ッ フ リ ン グ" に base づ く - different anti E_2 antibody の created を enterprise て た. に first set し た resistance E_2 antibodies ハ イ ブ リ ド ー マ strains よ り RNA を 単 し, rt-pcr に よ り H lock and び L lock can - (V_H, V_L) heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し た. こ れ ら を link し て a lock Fv フ ラ グ メ ン ト (scFv) の heritage 伝 を build し, そ の product で あ る wild-type scFv を with い ELISA line を っ て phenomenon in た results, free E_2 content 2-200 ng に お い て dosage far ら curve が れ た. This scFv heritage 伝 son を type where と し て in the presence of 0.5 and 1.0 mM MnCl_2 は で line error - prone PCR を い, - different ク ロ ー ン 27 の V_H and び V_L salt base with column を parsing し た と こ ろ, maximum 13% high の い sharper rate で point - different の import が recognize め ら れ た. で そ の party, V_H, V_L ド メ イ ン に 応 seaborne す る heritage 伝 son over の を そ れ ぞ れ 6 this の a lock synthetic オ リ ゴ DNA (5 'side か ら # 1 ~ # 6; お よ そ 60 ~ 120 killing の し fan に 囲) decomposition, こ れ を recursive PCR に pay す こ と で yuan の scFv posthumous son 伝 が reconstitution さ れ る こ と を confirm し た. Have ら れ た - traces of different scFv 伝 subgroup の CDR part を PCR に よ り rights of す る こ と で, - different traces of CDR 伝 son fragment group (# 2, 3, 5 に quite) を modulation す る こ と が で き る. こ れ ら を traces of wild type FR 伝 son fragment (# 1, # 4, # 6 に quite) と mixed し て recursive PCR に pay す こ と で have ら れ る CDR シ ャ ッ フ リ ン グ ラ イ ブ ラ リ ー か ら, affinity と specificity に れ る の - different antibodies might explore が と expect さ れ る.

项目成果

Takashi Iida: "^1H and ^<13>C NMR signal assignments of carboxyl-linked glucuronides of bile acids"Magnetic Resonance Chemistry. 41. 250-264 (2003)

Takashi Iida：“胆汁酸的羧基连接的葡糖苷酸的^ 1 H和^ 13 C NMR信号归属”磁共振化学。

Takashi Iida: "^1H and ^13C signal assignments of carboxyl-linked glucosides of bile acids"Magnetic Resonance in Chemistry. (in press). (2003)

Takashi Iida：“胆汁酸羧基连接糖苷的 ^1H 和 ^13C 信号分配”化学中的磁共振。

Norihiro Kobayashi: "Single-chain Fv fragments derived from an anti-11-deoxycortisol antibody : Affinity, specificity, and idiotype analysis"Steroids. 67. 733-742 (2002)

Norihiro Kobayashi：“源自抗 11-脱氧皮质醇抗体的单链 Fv 片段：亲和力、特异性和独特型分析”类固醇。

Naoto Nakagawa: "Brain and heart specific alteration of methamphetamine (MAP) distribution in MAP-senstized rat"Biological Pharmaceutical Bulletin. 26. 506-509 (2003)

中川直人：“MAP 致敏大鼠中甲基苯丙胺 (MAP) 分布的脑和心脏特异性改变”生物制药通报。

Nariyasu Mano: "Exopeptidase degradation for the analysis of phosphorylation site in a mono-phosphorylated peptide with matrix-assisted laser desorption mass spectrometry"Analytical Sciences. 19. 1469-1472 (2003)

Nariyasu Mano：“利用基质辅助激光解吸质谱法分析单磷酸化肽中磷酸化位点的外肽酶降解”分析科学。