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新世代抗体を活用する内分泌撹乱物質のハイスループットスクリーニングシステム

使用新一代抗体的内分泌干扰物高通量筛选系统

基本信息

批准号：
14042204
负责人：
後藤順一
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

環境中女性ホルモン様物質の影響を精査するために、エストラジオール(E_2)のハイスループットスクリーニング法が切望され、高親和力で特異的な抗体が求められている。野生型抗体の相補性決定部(CDR)にランダム変異を導入することにより高性能な改変抗体の創製が可能と期待される。そこで、error-prone PCRにより得られる変異CDR遺伝子断片を野生型抗体のフレームワーク(FR)遺伝子にランダムに組み込む"CDRシャッフリング"に基づく変異抗E_2抗体の創製を企てた。先に樹立した抗E_2抗体産生ハイブリドーマ株よりRNAを単離し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖可変部(V_H,V_L)遺伝子をクローニングした。これらを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)の遺伝子を構築し、その産物である野生型scFvを用いて競合ELISAを行った結果、遊離E_2添加量2-200ngにおいて用量作用曲線が得られた。本scFv遺伝子を鋳型として0.5又は1.0mM MnCl_2存在下でerror-prone PCRを行い、変異クローン27種のV_H及びV_L塩基配列を解析したところ、最大13%の高い効率で点変異の導入が認められた。その一方で、V_H、V_L各ドメインに対応する遺伝子の全長をそれぞれ6本の一本鎖合成オリゴDNA(5'側から#1〜#6;およそ60〜120merの範囲)に分解し,これをrecursive PCRに付すことで元のscFv遺伝子が再構成されることを確認した。得られた変異scFv遺伝子群のCDR部分をPCRにより増幅することで、変異CDR遺伝子断片群(#2、3、5に相当)を調製することができる。これらを野生型FR遺伝子断片(#1、#4、#6に相当)と混合してrecursive PCRに付すことで得られるCDRシャッフリングライブラリーから、親和力と特異性に優れる変異抗体の探索が可能と期待される。

The effect of female environmental substances on the environment was carefully investigated. The high affinity and specific antibodies were sought. The complementarity determining region (CDR) of wild-type antibodies is expected to be introduced into the system to improve the ability of antibody creation. The invention relates to the production of wild-type antibodies against E_2 by PCR, error-prone PCR, and CDR gene fragments. The first step is to establish anti-E2 antibody production, RT-PCR, H-lock and L-lock (V_H,V_L) gene detection. The results of ELISA showed that the reaction curve of 2-200ng free E_2 was obtained. In the presence of 1.0 mM MnCl2, error-prone PCR was performed with 27 different V_H and V_L base alignments resolved, and the highest conversion rate was 13%. The total length of the corresponding scFv gene was determined by PCR. The sequence was composed of 6 sequences of DNA(#1 ~#6; 60 ~ 120mer), and the sequence was reconstructed by PCR. PCR amplification of CDR fragments of different scFv fragments (#2,#3, and #5) was obtained. The wild-type FR fragments (#1,#4,#6) and hybrid recurrent PCR were found to have the potential to explore heteroantibodies with high affinity and specificity.