脳ホスホリパーゼDのクローニングと機能解析

脑磷脂酶D的克隆及功能分析

• 批准号: 10155204
• 负责人: 山下 哲
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10155204/
• 关键词: ホスホリパーゼD; 脳; ショウジョウバエ; 発生; アラキドン酸; アナンダミド; リゾホスファチジルセリン

1. オレイン酸活性化型ホスホリパーゼD(PLD)精製の過程で酵素を強く阻害する脂質性阻害因子がブタ大腸粘膜に存在することを見出したのでそれらの精製,同定を行った.内在性PLD阻害因子はリゾホスファチジルセリン,ホスファチジルイノシトール,リゾホスファチジルイノシトールと同定された.またこれらのリン脂質をPLD1,PLD2,および脂肪酸依存性PLDに添加するといずれのPLDアイソホームも低濃度(10μMオーダー)で阻害した.2. 神経発生におけるPLDの役割を明らかにするためショウジョウバエのホスホリパーゼD遺伝子とcDNAをクローニングした.ショウジョウバエPLDは1278アミノ酸残基から成り,分子量は145Kであった.動植物,酵母のPLDで共通してみられる5個所のコンセンサスはすべて含まれており,PXドメイン,PHドメイン,および活性部位と考えられる2つのHKDモチーフは完全に保存されていた. dPLDとPLD1, PLD2との相同性はそれぞれ37,36%でそれらと等距離にあると考えられた.遺伝子は第2染色体(2R42A16-18)にマップされた. RNAプローブを作成し,in situ hybridizationによってPLDが発生のどの時期に発現するのか調べたところ,発生過程の中で卵,およびblastoderm初期にのみ発現しておりdPLDが発生初期に機能する酵素であることが示唆された.3. アナンダミドは1-アラキドノイルPCから合成されるが,この脂質がどのようにして生ずるのかわかっていなかった.最近我々が精製,クローニングした60Kリゾホスホリパーゼのトランスアシラーゼ活性を詳細に調べたところ,酵素は2-アラキドノイルリゾPCからアラキドン酸を別の分子の2-アラキドノイルリゾPCの1位に転移させる機能を有することが判明し,この酵素がアナンダミド合成の前駆体生成に関与していることが示唆された.

Type 1. オ レ イ ン acid activation ホ ス ホ リ パ ー ゼ D (PLD) process of refined の で enzyme を く strong resistance against す る lipid sexual resistance against factor が ブ タ colon mucosa に exist す る こ と を shows し た の で そ れ ら の refined, with fixed line を っ た. Internality PLD resistance against factor は リ ゾ ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン, ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル, リ ゾ ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル と with fixed さ れ た. ま た こ れ ら の リ ン lipid を PLD1, PLD2, お よ び fatty acids dependency PLD に add す る と い ず れ の PLD ア イ ソ ホ ー ム も low concentration (10 mu M ダ ダ)で hindrance た.2. God 経 発 raw に お け る PLD の "を cut Ming ら か に す る た め シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の ホ ス ホ リ パ ー ゼ D heritage 伝 son と cDNA を ク ロ ー ニ ン グ し た. シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ PLD は 1278 ア ミ ノ acid residues か ら り, molecular weight は 145 k で あ っ た. Common animals and plants, and yeast の PLD で し て み ら れ る の by five コ ン セ ン サ ス は す べ て containing ま れ て お り, PX ド メ イ ン, PH ド メ イ ン, お よ び active site と exam え ら れ る 2 つ の HKD モ チ ー フ は に completely preserved さ れ て い た. DPLD と PLD1, PLD2と <s:1> congruent homogeneity それぞれ それぞれ37,36%でそれらと equidistant にあると test えられた. Posthumous son 伝 は chromosome 2 (2 r42a16-18) に マ ッ プ さ れ た. RNA プ ロ ー ブ を し consummate, the in situ Hybridization に よ っ て PLD が 発 raw の ど の period に 発 now す る の か adjustable べ た と こ ろ, 発 process の で eggs, お よ び blastoderm early に の み 発 now し て お り dPLD が 発 born early に function す る enzyme で あ る こ と が in stopping さ れ た. 3. 1 - ア ア ナ ン ダ ミ ド は ラ キ ド ノ イ ル PC か ら synthetic さ れ る が, こ の lipid が ど の よ う に し て raw ず る の か わ か っ て い な か っ た. I recently 々 が refined, ク ロ ー ニ ン グ し た 60 k リ ゾ ホ ス ホ リ パ ー ゼ の ト ラ ン ス ア シ ラ ー ゼ active を detailed に adjustable べ た と こ ろ, enzyme は 2 - ア ラ キ ド ノ イ ル リ ゾ PC か ら ア ラ キ ド を don't の ン acid molecules の 2 - ア ラ キ ド ノ イ ル リ ゾ PC の one に planning move さ せ る function を have す る こ と が determine し, こ の enzyme が ア ナ ン ダ ミ ド synthetic の 駆 body generated before に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

Yoshida,M.et al.: "Enhanced levels of oleate-dependent and Arf-dependent phospholipase D isoforms in experimantal colon cancer" Oncol.Res.(印刷中).

Yoshida, M. 等人：“实验性结肠癌中油酸依赖性和 Arf 依赖性磷脂酶 D 同种型的水平增强”Oncol.Res。

Katayama,K.et al.: "Cloning,differential regulation and tissue distribution of alternatively spliced isoforms of ADP-ribosylation factor-dependent phospholipase D from rat liver" Biochem.J.329. 647-652 (1998)

Katayama，K.et al.：“来自大鼠肝脏的 ADP-核糖基化因子依赖性磷脂酶 D 的选择性剪接异构体的克隆、差异调节和组织分布”Biochem.J.329。

Sugimoto,H.et al.: "Characterization of the transacylase activity of rat liver 60-kDa lysophospholipase-transacylase" Biochim.Biophys.Acta. (印刷中).

Sugimoto, H. 等人：“大鼠肝脏 60-kDa 溶血磷脂酶-转酰基酶活性的表征”Biochim.Biophys.Acta（出版中）。

山下 哲: "生物薬科学実験講座 第3巻" 広川書店, 315 (1998)

山下聪：《生物制药科学实验教程第3卷》广川书店，315（1998）

Toyoda,T.et al.: "Sequence,expression in Escherichia coli,and characterization of lysophospholipase II" Biochim.Biophys.Acta. 1437. 182-193 (1999)

Toyoda,T.et al.：“序列、在大肠杆菌中的表达以及溶血磷脂酶 II 的表征”Biochim.Biophys.Acta。