転写モーターの1分子可視化実時間計測法による解明

顕微鏡を用いたDNA結合タンパク質のDNAに沿った運動の観察を容易にするため、DNAを伸長することでタンパク質分子の運動を直線運動として検出する方法を開発した。DNA分子を伸長したまま保持するために、ガラス基盤上に蒸着したアルミにフォトリソグラフィー加工を施すことでアルミ電極を作製し、電極間でDNA分子に1MV/mの高周波電界を印加することでDNAを伸長させ、DNAの末端とアルミ電極との結合により伸長した分子のまま固定した。100μmのギャップ長をもち、電源に接続されて直接電圧の印加を受ける一対のアルミ電極の間には、さらに電源に繋がっていないが自然と電位が決まるフローティングポテンシャル電極を5本配置した。このような電極の構造は、直接電圧のかかる電極だけを配した構造よりも対流がおこり難くDNAが伸長固定されやすい特長を有する。電極の形状によるDNAの伸長固定化の効率の違いを調べるためにフローティングポテンシャル電極の幅を0.5から3μmまで、ギャップ長を8から11μmに変化させたものでT7DNA及びλDNAを伸長固定したところ、電極の幅が3μm、ギャップ長8μmの場所にDNAが多く固定される結果が得られた。多くのDNA結合タンパク質はDNAの周りをつつむようにDNAと結合するといわれているので、DNAが基盤に接触した状態で固定されるとタンパク質分子が基盤に吸着してしまう可能性がある。そこで3%フッ化アンモニウム、50%硫酸、50%水からなるエッチング液を電極上に滴下し、1分間反応させることにより電極のギャップにあるガラス部分を1μm掘りDNAと基盤が接触しにくくなる工夫をした。この伸長固定化DNAを用いて可視化した制限酵素EcoRIタンパク質の分子運動を観察したところDNA上を滑るように運動するスライディングが同定された。

顕微鏡を用いたDNA結合タンパク質のDNAに沿った運動の観察を容易にするため、DNAを伸長することでタンパク質分子の運動を直線運動として検出する方法を開発した。DNA分子を伸長したまま保持するために、ガラス基盤上に蒸着したアルミにフォトリソグラフィー加工を施すことでアルミ電極を作製し、電極間でDNA分子に1MV/mの高周波電界を印加することでDNAを伸長させ、DNAの末端とアルミ電極との結合により伸長した分子のまま固定した。100μmのギャップ長をもち、電源に接続されて直接電圧の印加を受ける一対のアルミ電極の間には、さらに電源に繋がっていないが自然と電位が決まるフローティングポテンシャル電極を5本配置した。このような電極の構造は、直接電圧のかかる電極だけを配した構造よりも対流がおこり難くDNAが伸長固定されやすい特長を有する。電極の形状によるDNAの伸長固定化の効率の違いを調べるためにフローティングポテンシャル電極の幅を0.5から3μmまで、ギャップ長を8から11μmに変化させたものでT7DNA及びλDNAを伸長固定したところ、電極の幅が3μm、ギャップ長8μmの場所にDNAが多く固定される結果が得られた。多くのDNA結合タンパク質はDNAの周りをつつむようにDNAと結合するといわれているので、DNAが基盤に接触した状態で固定されるとタンパク質分子が基盤に吸着してしまう可能性がある。そこで3%フッ化アンモニウム、50%硫酸、50%水からなるエッチング液を電極上に滴下し、1分間反応させることにより電極のギャップにあるガラス部分を1μm掘りDNAと基盤が接触しにくくなる工夫をした。この伸長固定化DNAを用いて可視化した制限酵素EcoRIタンパク質の分子運動を観察したところDNA上を滑るように運動するスライディングが同定された。