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免疫グロブリン遺伝子導入マウスを利用したヒト型高親和性抗体の作製と抗体遺伝子解析

利用免疫球蛋白转基因小鼠制备高亲和力人抗体并进行抗体基因分析

基本信息

批准号：
10877080
负责人：
赤水尚史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスを用いて、ヒト型抗TSH受容体抗体の作製と同抗体遺伝子解析を試みている。本年度は、抗原であるTSH受容体の精製と解析をさらにすすめた。TSH受容体蛋白として、バキュロウイルス系のシステムによつて大量発現精製し、これを精製している。すなわち、我々はこれまでに以下の方法によりC末端にHis tagを融合させた可溶型TSHRの作成を行った。この方法によつて、我々は初めて細胞の培養上に可溶性TSHRを分泌させることに成功した。また、ヒトTSHRあるいはバキュロウイルスgp67蛋白質のシグナル配列を付加したTSHRの細胞外ドメインをコードするsTSHR-Wild(aa1-410)、sTSHR-gp(aa21-410)を作製し、その発現、性状を比較検討した。その結果、sTSHR-Wild及びsTSHR-gpは細胞上清画分から約58KDa、細胞抽出画分から約62、49KDaの蛋白質として検出された。両面分の可溶型TSHRのサイズの違いを検討するため、グリコシダーゼを用いて糖鎖の同定を行ったところ、細胞抽出画分の可溶型TSHRはハイマンノース型糖鎖を、細胞上清画分の可溶型TSHRは欠失型ハイマンノース型糖鎖を持っていた。さらにバセドウ病患者血清中の抗TSHR抗体との結合性を検討したところ、両面分から得られたsTSHR-Wild、sTSHR-gpどちらも抗TSHR抗体と結合したが、sTSHR-gpの方が抗体結合が高かった。また、TSHに対する結合性はsTSHR-gpの細胞上清画分にのみ確認された。これらのことから可溶性TSHRの細胞上清の分泌性には付加される糖鎖が重要であるが、抗体との結合には影響を与えないものと思われた。しかしシグナル配列の違いにより抗体結合性に差が生じたことから、バキュロウイルスのシグナル配列を付加した方がよりnativなTSHRを作製できるものと考えられた。ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XenoMouse II)供給を日本たばこ産業株式会社医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。

We have been trying to use the immune system to introduce anti-TSH receptor antibodies and to analyze the anti-TSH receptor antibodies This year, the antigen was purified and analyzed. TSH receptor protein is produced and refined in large quantities. The following methods were used to prepare soluble TSHR by fusing His tag at the C-terminal. This method was successful in the secretion of soluble TSHR in cultured cells. In addition, the TSHR gene expression and protein sequence of TSHR gene were also studied. sTSHR-Wild(aa1-410) and sTSHR-gp(aa21-410) were produced, developed and characterized. The results showed that sTSHR-Wild and sTSHR-gp cell supernatant fractions were about 58KDa, cell extract fractions were about 62 KDa and 49KDa protein fractions were about 58 KDa. The soluble TSHR of the cell extract is the same as that of the soluble TSHR of the cell extract. Anti-TSHR antibodies in sera from patients with acute respiratory syndrome were highly conjugated to sTSHR-Wild and sTSHR-gp. The binding of TSH to sTSHR-gp in cell supernatant was confirmed. The secretion of soluble TSHR is important for the binding of antibodies. The difference in antibody binding between the two groups is due to the increase in the number of TSHRs. The introduction of the immune system into the virus (XenoMouse II) was supplied by Japan's Medical Research Institute, Kubota.