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ヒト透過性細胞を用いたDNA複製装置の免疫組織化学的解析

使用人透化细胞对 DNA 复制装置进行免疫组织化学分析

基本信息

批准号：
11137303
负责人：
吉田松年
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11137303/
关键词：
Rb蛋白リン酸化 DNAポリメラーゼα G1期 S期細胞増殖複製工場サイクリン cdk

项目摘要

がん細胞は生体の制御を逸脱した無限増殖を特徴とする。細胞増殖は多重の制御機構のうち最も重要なものは、がん抑制遺伝子Rbの作り出すRb蛋白を介する調節経路である。我々はヒトRb蛋白の全長をバキュロウイルス一昆虫細胞系にて発現させ、抗Rb抗体カラムで精製した。リン酸化された精製Rb蛋白はDNAポリメラーゼαの反応を強く促進した。Rb蛋白を脱リン酸化酵素PP2Aで処理すると促進活性は低下し、逆に、cdk2/cyclineEを共発現して高度リン酸化型にすると促進は増強した。G1期には低リン酸化Rb蛋白がE2Fなど転写因子を不活性化してS期開始をブロックしているが、cdk/cyclin系によりリン酸化されると転写制御が解消すると同時に、リン酸化Rbそれ自体がDNA複製に促進的に作用することを示唆する。Rb蛋白は核内に比較的多量に存在し、抗Rb抗体で細胞を処理すると核全体が染色される。一方、リン酸化Rb特異的な抗体では斑点状に染まり、局在がより明瞭となった。この高リン酸化RbとDNA複製点の局在が一致するかどうかを調べるため、本国際共同研究をスタートした。共同研究者英国オックスフォード大学Peter R.Cook教授は、種々の抗体を用いた免疫組織化学を駆使した形態学的解析から、核内に複製工場(replication factory)と名づけた構造体を同定した。これはDNA複製点を中心として、複製関連酵素およびそれらの調節因子よりなる巨大複合体であって、DNAはこの複合体を通り抜ける形で複製するモデルを提出している。平成11年度は、日本側共同研究者の一人である武村が数カ月にわたりオックスフォード大学に滞在し、上記研究を遂行するための技術を修得した。今後、活性促進に必要なRb蛋白ドメインとそのリン酸化を解析すると共に、リン酸化Rbの核内の局在とダイナミズムをreplication factoryのメンバーであるDNAポリメラーゼα、δ、ε、PCNA、RP-A等との関連において明らかにする。

The characteristics of cell proliferation The most important regulatory mechanism for cell proliferation is the inhibition of Rb protein expression in the regulatory pathway. The full length of Rb protein was developed in an insect cell line and anti-Rb antibody was purified. Refined Rb protein is a strong promoter of DNA. Rb protein deacidification enzyme PP2A processing promotes low, reverse, cdk2/cycline co-expression and high deacidification activity. G1 phase is the first phase of inactivation of Rb protein, E2F and cyclin gene expression factors, and the second phase of inactivation of Rb protein, E2F and cyclin gene expression factors, cdk/cyclin gene expression systems and cyclin gene expression systems. Rb protein is present in relatively large amounts in the nucleus, and anti-Rb antibodies are present in the entire nucleus. A side, acid Rb specific antibody is not spotted, the bureau is clear. The high level of Rb and DNA replication sites are in agreement, and this international joint study is underway. Co-investigator Professor Peter R.Cook of the University of London, UK, identified the morphological, nuclear replication and structural features of the antibody using immunohistochemistry. The DNA replication center, replication-related enzymes, and regulatory factors are the largest complexes in the world. One of the Japanese co-researchers in Heisei 11 was able to complete the research at the university. In the future, it is necessary to analyze Rb protein and its acidification in order to promote its activity.