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無機炭素輸送の制御機構

无机碳传输的控制机制

基本信息

批准号：
11151220
负责人：
福澤秀哉
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.最小プロモーターを用いたCO2応答性転写調節領域の同定クラミドモナス炭酸脱水酵素遺伝子CAH1上流域に予測された転写調節領域をβ2-チューブリンの最小プロモーターに連結して転写調節領域を更に短い領域に限定することができた。高CO2条件で転写抑制を担う領域(S-region)は,-351から-294の58塩基であり,低CO2で転写を活性化する領域(E-region)は,-293から-231の63塩基であった。この部分についてリンカースキャニング法により,転写調節シス配列を推定した。高CO2で培養した細胞と低CO2条件に移して2時間処理した細胞から単離した核抽出液を用いて,E-regionとS-regionについてゲルシフトアッセイを行った。E-regionでは,低CO2の核抽出液で1本、高CO2の核抽出液では3本の移動度の異なるバンドを検出した。S-regionでは,低CO2の核抽出液で1本、高CO2の核抽出液では2本の移動度の異なるバンドを検出した。どちらの領域にも,低CO2、高CO2条件で、異なる複数種のタンパク質がDNAに特異的に結合し,転写活性を制御していると考えられた。2.遺伝子タギング法によって得た高CO2要求性変異株C16低CO2条件に順化できない変異株C16の変異原因遺伝子CCM1をタギングによって単離した。細胞内での発現量は,非常に低かったことから,RT-PCRをおこない,全長cDNAを得た。cDNAのタンパク質コード領域を大腸菌発現ベクターに導入し,ヒスチジンタグを付けて大腸菌からタンパク質を回収し,抗体の作製を行った。また,遺伝子産物の細胞内局在を明らかにするために,推定タンパク質のC-末端にHAタグを付けたプラスミドを作製し,変異株C16に形質転換して変異が相補した株を単離した。HA抗体を用いて,変異相補株におけるCCM1タンパク質の細胞内局在を調べている。このタンパク質遺伝子は、CO2濃度を検知・制御するシグナル伝達系に関わる遺伝子である可能性が高い。3.CO2濃度変化に応答できない変異株の単離高CO2条件でもCAH1遺伝子が恒常的に発現してしまう株をNIT1遺伝子の挿入変異によって新しく2株得た。また、同じ変異株ライブラリーから低CO2条件でレポーター遺伝子が発現しなくなる株を4株得た。変異株の中には,CAH1遺伝子の転写調節に直接関わる因子が変異していると考えられる株が含まれていた。

1. CO2-responsive regulatory domain for minimum level of activity is determined by the presence of a carbon dehydrator enzyme in the upper watershed of CAH1, and the presence of a β2-responsive minimum level of activity is determined by the presence of a link to a shorter regulatory domain. Under high CO2 conditions, write inhibition domain (S-region) is-351-294 58, while under low CO2 conditions, write activation domain (E-region) is-293-231 63. This part of the regulation is based on the estimation of the regulation. Cell culture under high CO2 and low CO2 conditions for 2 days, cell culture under low CO2 conditions, cell culture conditions, cell culture under low CO2 conditions, cell culture under low CO2 conditions E-region, low CO2 nuclear extract, high CO2 nuclear extract, high CO2 nuclear extract, low CO2 nuclear extract, high CO2 nuclear extract, high nuclear extract, high CO2, high nuclear extract, high CO2, high nuclear extract, high nuclear extract, high nuclear S-region: low CO2 nuclear extract, high CO2 nuclear extract, and high CO2 nuclear extract. In addition, under the conditions of low CO2 and high CO2, a plurality of different substances are combined with DNA specifically, and the activity of DNA is controlled. 2. The high-CO2-requiring mutant C16 obtained by the genetic engineering method was transformed into the mutant C16 in Hue under low-CO2 conditions, and the genetic engineering CCM1 was developed by the genetic engineering method. The amount of cDNA expressed in the cell was very low,RT-PCR was very low, and full-length cDNA was obtained. The cDNA fragment was introduced into E. coli, and the cDNA fragment was recovered from E. coli. In addition, the intracellular structure of the gene product was determined to be different from that of the C-terminal HA of the putative strain C16. HA antibody is used in the middle, different phase complement strain, CCM1, CCM 1, CC The probability of detection and control of CO2 concentration in the environment is high. 3. CO2 concentration changes in different plants under high CO2 conditions, CAH1 gene is constantly present, NIT1 gene is introduced differently, and 2 plants are new. 4 plants of the same species were obtained under low CO2 conditions. In addition, CAH1 gene expression is directly related to the regulation of gene expression.