選択的スプライシングのリン酸化制御機構

选择性剪接的磷酸化控制机制

• 批准号: 11155208
• 负责人: 萩原 正敏
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11155208/
• 关键词: SRPK; SF2; ASF; splicing

我々はSRPK1と分裂酵母の細胞周期制御遺伝子Dsk1の高い相同性に着目して、マウス脳mRNAより新規のSR蛋白リン酸化酵素をクローニングし、SRPK2と名付けた。大腸菌で発現させたSRPK1とSRPK2を用いて、GST-SF2Pull-Down Kinase Assayを行ったところ、SF2/ASFに結合してリン酸化活性を示した。実際に細胞内でもSF2/ASFとSRPKが複合体を形成しているかどうか調べるためCOS7細胞にSF2/ASFとSRPKを共発現させ、共沈実験およびkinase-assayを行ったところ、SF2/ASFとSRPKは細胞内においても結合していることが確認できた。またSF2/ASFのdeletion mutantを用いた解析により、このSF2/SRPK複合体の形成にはRSドメインが必須で、その結合部位はSRPKによるリン酸化部位と一致することが確認できた。さらにSF2/ASFのリン酸化状態により結合能に差がみられるかを調べたところ、リン酸化されていないSF2/ASFとSRPKは複合体を形成するが、リン酸化されたSF2/ASFとSRPKはもはや結合しなかった。リン酸化活性化能をもたないSRPK2^<K108R>をHeLa細胞内で発現させたところ、核内でspeckled patternを示していたSF2/ASFは核外に移行した。この結果よりSF2/ASFの細胞内局在は、SRPKによって制御されている可能性があると考えられる。

SRPK1 and SRPK2 share a high degree of identity with the cell cycle control gene Dsk1, which regulates the expression of SRPK1 and SRPK2. SRPK1 and SRPK2 were detected in E. coli, GST-SF2 Pull-Down Kinase Assay was performed, SF2/ASF binding was performed, and acidification activity was demonstrated. In fact, SF2/ASF and SRPK complexes are formed in cells, and SF2/ASF and SRPK complexes are co-developed and co-deposited in COS7 cells. The kinase-assay is performed in cells, and SF2/ASF and SRPK complexes are combined in cells. The SF2/ASF deletion mutant was analyzed and confirmed to be a necessary part of the formation of the SF2/SRPK complex. SF2/ASF and SRPK complexes are formed in the presence of different binding energies, and the binding energies of SF2/ASF and SRPK are different. SRPK2^<K108R>is an active protein in HeLa cells. It can be expressed as a speckled pattern in the nucleus. The result is that SF2/ASF is in the cell, SRPK is in the cell, and SRPK is in the cell.

项目成果

Nagai Y, Miyazaki M, Aoki R, Zama T, Inoue S, Hirose K, Iino M, Hagiwara M: "Detection of cAMP-induced phosphorylation with a novel fluorescent indicator."Nat.Biotechnol.. (in press). (2000)

Nagai Y、Miyazaki M、Aoki R、Zama T、Inoue S、Hirose K、Iino M、Hagiwara M：“用新型荧光指示剂检测 cAMP 诱导的磷酸化。”Nat.Biotechnol..（出版中）。

Koizumi, J., Okamoto, Y., Onogi, H., Maekawa, A., Hagiwara, M.: "The subcellular localization of SF2/ASF is regulated by the direct interaction with SR protein kinases (SRPKS)"J. Biol. Chem.. 274. 11125-11131 (1999)

Koizumi, J.、Okamoto, Y.、Onogi, H.、Maekawa, A.、Hagiwara, M.：“SF2/ASF 的亚细胞定位是通过与 SR 蛋白激酶 (SRPKS) 的直接相互作用来调节的”J.