内皮型NO合成酵素遺伝子-786C変異へ結合するサプレッサーの機能解析

内皮NO合酶基因-786C突变抑制子结合的功能分析

• 批准号: 11158209
• 负责人: 斎藤 能彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11158209/
• 关键词: eNOS遺伝子; 遺伝子多型; 転写抑制因子; RPA1

冠攣縮性狭心症と有意に関連しているeNOS遺伝子5'転写調節領域のT-786C変異の機能解析を行った。T-786C変異はルシフェラーゼリポーター遺伝子に結合してHUVECさにトランスフェクションしルシフェラーゼ活性を測定した、この変異により転写活性が30%低下した。-786C変異型DNAへの結合活性を指標にこの変異に結合する転写因子をHela細胞核蛋白質300mgより精製した。アミノ酸配列を決定した結果この蛋白質はreplication proteinA1と同一の蛋白質であった。-786C変異型DNAをプローブにしたゲルシフトアッセイでは、GST融合型のGSTに対する抗体でスーパーシフトした。RPA1cDNAを発現ヴェクターに挿入しCOS1細胞にeNOS変異型遺伝子リポーター遺伝子と共発現させるとRPA1の過剰発現によりリポーター活性はより低下した。また、RPA1のアンチセンスoligonucleotideをやはりリポーター遺伝子と共にHUVECに共発現させるとアンチセンスoligonucleotideはリポーター活性の低下を有意に抑制した。以上のことからRPA1がサプレッサーとしてT-786C変異型遺伝子にサプレッサーとして働いて変異型遺伝子の転写活性を抑制していることが証明された。また、イントロン4にはVNTR変異が以前より報告されており、この変異と虚血性心疾患の関連が報告されていたがこの変異とT-786C変異は連鎖不均衡にあることを日本人の症例で確認した。このことによりイントロン4のVNTR変異の機能的な原因LociはT-786C変異であることが示唆された。

eNOS基因的5'转录调节区域中T-786C突变的功能分析与冠状动脉痉挛性心绞痛显着相关。 T-786C突变与荧光素酶报告基因结合并转染到HUVEC中以测量荧光素酶活性，并且该突变使转录活性降低了30％。使用与-786C突变DNA作为指标的结合活性，将这种突变结合的转录因子从300 mg HELA细胞核蛋白中纯化。确定氨基酸序列，蛋白质与复制蛋白1的蛋白质相同。在用-786C突变体DNA探测的凝胶转移测定中，对GST融合类型的抗体进行了超移。当RPA1 cDNA插入表达载体并与COS1细胞中的eNOS突变基因报告基因共表达时，RPA1的过表达进一步降低了报告基因的活性。此外，当RPA1的反义寡核苷酸与报告基因一起共表达时，反义寡核苷酸显着抑制了报告基因活性的降低。从以上，已经证明RPA1是T-786C突变基因的抑制剂，从而抑制了突变基因的转录活性。此外，先前已经在内含子4中报道了VNTR突变，并且已经报道了这种突变与缺血性心脏病之间的联系，但是在日本情况下，这种突变和T-786C突变处于联系差异。这表明基因座（内含子4 VNTR突变的功能原因）是T-786C突变。

项目成果

E. Ogawa: "Outside-in Signaling of Fibronectin Stimulates Cardiomyocyte Hyper-trophy in Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes"J. Mol. Cell. Cardiaol. (in press). (2000)

E. Okawa：“纤连蛋白的由外向内信号刺激培养的新生大鼠心室肌细胞中的心肌细胞肥大”J。