cGMP系関連遺伝子多型に基づいた循環器疾患遺伝的要因の解明とその医療への応用

基于cGMP系统相关基因多态性阐明心血管疾病遗传因素及其在医疗中的应用

• 批准号: 12204066
• 负责人: 斎藤 能彦
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12204066/
• 关键词: eNOS遺伝子; 遺伝子多型; SNPs; 冠攣縮性狭心症; サプレッサー; RPA1

邦人に多発する冠攣縮性狭心症の成因を研究する上で、この成因にeNOS遺伝子異常が関与しているとの仮説に基づき、冠攣縮性狭心症と健常対象者それぞれ10名のDNAを用いて、eNOS遺伝子全エクソンと5'転写調節領域1.6Kbpにわたり、SSCP法で点変異を検索した。その結果、エクソン7のミスセンス変異(Glu298Asp変異)と、5'転写調節領域に、3カ所の点変異(T-786C,G-922C,T-1468A変異)を見つけた。5'転写調節領域の3つの変異は同一対立遺伝子上に存在していたが、ゲルシフトアッセイ等の検討によりg-786C変異が機能的であることが示唆された。さらに、T-786C変異部位を11bp欠失させた変異リポーターを作製してルシフェラーゼアッセイを行ったところ、この欠失クローンは野生型クローンと同等までルシフェラーゼ活性が回復した。これらの結果より、T-786C変異にサプレッサー蛋白質が結合していることが示唆された。T-786C変異近傍は既知の転写調節配列と相同性が認められず、このサプレッサーを精製することにした。この蛋白質を精製するにあたりHela細胞の核蛋白質を300mg調整し、2段階のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティービーズにて、SDS-PAGE上50Kdのシングルバンドに精製することに成功した。この蛋白質をゲルより抽出し、アミノ酸配列を決定した。この決定されたアミノ酸配列はreplication protein A(RPA)の部分配列と100%一致した。さらにゲルシフトのシフトバンドはRPAに対する抗体でスーパーシフトし、また、リコンビナントRPAを用いても同様のゲルシフトが確認された。さらに、RPAの転写開始点付近の塩基配列を基にしたアンチセンスをHUVECに導入すると変異型リポーター活性が有意に回復することが確認された。これらの一連の結果より変異型eNOS遺伝子の転写はRPAを介して抑制されていることが証明された。

基于以下假设：eNOS基因异常参与该基因的研究，用于研究冠状动脉痉挛性心绞痛的原因（经常发生在日本人中），使用SSCP方法搜索了点突变，使用10个个体的DNA，每个人，每个冠状动脉痉挛性疾病和健康的受试者，遍布所有eNOS Gene exe exe and condional condional condional condional confortional and condional condional condional condional condional condional confortion and condional condional condional and condional condional and condient。结果，我们在5'转录调节区域中发现了外显子7（GLU298ASP突变）和三个点突变（T-786C，G-922C和T-1468A突变）的错义突变。在同一等位基因上存在5'转录调节区域中的三个突变，但是诸如凝胶转移测定的研究表明G-786C突变是功能性的。此外，产生了具有11 bp缺失的突变报告基因，并进行了荧光素酶测定，并进行了荧光素酶测定，并将该缺失克隆的荧光素酶活性恢复到与野生型克隆相同的水平。这些结果表明抑制蛋白与T-786C突变结合。未发现T-786C突变与已知的转录调节序列具有同源性，因此该抑制剂被纯化。为了纯化该蛋白质，通过300 mg调节了HeLa细胞的核蛋白，并使用两个离子交换色谱和亲和力珠子成功地纯化为SDS-PAGE的单个50KD。从凝胶中提取该蛋白，并确定氨基酸序列。该确定的氨基酸序列100％与复制蛋白A（RPA）的子序列一致。此外，对RPA的抗体对凝胶移位带进行了超移，并使用重组RPA确认了类似的凝胶移位。此外，已经证实，基于RPA转录起点附近的基本序列的反义显着恢复了突变者的活性。这些结果表明，突变eNOS基因的转录通过RPA抑制。

项目成果

Y.Mizuno: "Aldosterone Production is Activated in the Failing Ventricles in Humans."Circulation.. 103. 72-77 (2001)

Y.Mizuno：“醛固酮的产生在人类衰竭的心室中被激活。”循环.. 103. 72-77 (2001)

I.Hamanaka: "Induction of JAB/SOCS-1/SSI-1 and CIS3/SOCS-3/SSI-3 Is Involved in gp130 Resistance in Cardiovascular System in Rat Treated with Cardiotrophin-1 (CT-1) in vivo."Circ.Res.. (In press). (2001)

I.Hamanaka：“JAB/SOCS-1/SSI-1 和 CIS3/SOCS-3/SSI-3 的诱导参与体内用 Cardiotropin-1 (CT-1) 治疗的大鼠心血管系统中的 gp130 耐药性。”

E.Ogawa: "Outside-in Signaling of Fibronectin Stimulates Cardiomyocyte Hypertrophy in Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes"J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)

E.Okawa：“纤连蛋白的由外向内信号刺激培养的新生大鼠心室肌细胞中的心肌细胞肥大”J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)

K.Kuwahara: "Cardiotorphin-1 phosphorylates Akt and BAD, and prolongs cell survival via a PI3K-dependent pathway in cardiac myocytes."J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)

K.Kuwahara：“Cardiotorphin-1 磷酸化 Akt 和 BAD，并通过心肌细胞中的 PI3K 依赖性途径延长细胞存活时间。”J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)

S.Asai: "The Heart Is a Source of Circulating Cardiotrophin-1 in Humans"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 279. 320-323 (2000)

S.Asai：“心脏是人类循环 Cardiotropin-1 的来源”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 279. 320-323 (2000)