cGMP系関連遺伝子多型に基づいた循環器疾患遺伝的要因の解明とその医療への応用

基于cGMP系统相关基因多态性阐明心血管疾病遗传因素及其在医疗中的应用

• 批准号: 12204066
• 负责人: 斎藤 能彦
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12204066/
• 关键词: eNOS遺伝子; 遺伝子多型; SNPs; 冠攣縮性狭心症; サプレッサー; RPA1

邦人に多発する冠攣縮性狭心症の成因を研究する上で、この成因にeNOS遺伝子異常が関与しているとの仮説に基づき、冠攣縮性狭心症と健常対象者それぞれ10名のDNAを用いて、eNOS遺伝子全エクソンと5'転写調節領域1.6Kbpにわたり、SSCP法で点変異を検索した。その結果、エクソン7のミスセンス変異(Glu298Asp変異)と、5'転写調節領域に、3カ所の点変異(T-786C,G-922C,T-1468A変異)を見つけた。5'転写調節領域の3つの変異は同一対立遺伝子上に存在していたが、ゲルシフトアッセイ等の検討によりg-786C変異が機能的であることが示唆された。さらに、T-786C変異部位を11bp欠失させた変異リポーターを作製してルシフェラーゼアッセイを行ったところ、この欠失クローンは野生型クローンと同等までルシフェラーゼ活性が回復した。これらの結果より、T-786C変異にサプレッサー蛋白質が結合していることが示唆された。T-786C変異近傍は既知の転写調節配列と相同性が認められず、このサプレッサーを精製することにした。この蛋白質を精製するにあたりHela細胞の核蛋白質を300mg調整し、2段階のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティービーズにて、SDS-PAGE上50Kdのシングルバンドに精製することに成功した。この蛋白質をゲルより抽出し、アミノ酸配列を決定した。この決定されたアミノ酸配列はreplication protein A(RPA)の部分配列と100%一致した。さらにゲルシフトのシフトバンドはRPAに対する抗体でスーパーシフトし、また、リコンビナントRPAを用いても同様のゲルシフトが確認された。さらに、RPAの転写開始点付近の塩基配列を基にしたアンチセンスをHUVECに導入すると変異型リポーター活性が有意に回復することが確認された。これらの一連の結果より変異型eNOS遺伝子の転写はRPAを介して抑制されていることが証明された。

Study on the cause of coronary contracture stenosis by kunito's research on the causes of coronary contracture stenosis The 10-name DNA いて of the target person, the eNOS legacy エクソンと5'転 writing adjustment field 1.6Kbp にわたり, and the SSCP method で点変different を検 Sol した.その Results, エクソン7のミスセンス変different (Glu298Asp変different)と, 5'绢WRITING ADJUSTMENT COLLAR The differences between the domain and the three locations (T-786C, G-922C, T-1468A) are different. 5' 転WRITING REGULATION FIELDS の 3 つ の変 DIFFERENT は Same 対立缝子上に EXISTENCE していたが、ゲルシフThe トアッセイの検柁によりg-786C 変different function is a であることが出款された.さらに、T-786C 変different parts を11bp missing させた変 Differentiation リポーターを produced by してルシフェラーゼアッThe セイを行ったところ, the このowed loss クローンは wild-type クローンとequivalent までルシフェラーゼactive がした.これらのRESULTS より、T-786C変different にサプレッサーprotein が合していることが说唆された. The T-786C is different from the previous one and has the same adjustment and arrangement as the known one.このprotein を purified するにあたりHela cell のnuclear protein を 300mg adjusted し, 2-stage のイオン exchange クロマトグラフィー, アフィニティービーズにて, 50Kd のシングルバンドにRefined することに successful した on SDS-PAGE.このprotein をゲルより extracted し, アミノacid sequence をdetermined した. The partial alignment of replication protein A (RPA) is 100% consistent. Antibody , また, リコンビナントRPAを Use いても同様のゲルシフトが to confirm された.さらに、RPAの転writestart point paynearの塩综合组をbasedにしたアンチセンスをHUV EC に imported す る と 変 heterogeneous リ ポ ー タ ー active が intended に reply す る こ と が confirmed さ れ た.これらの一连のRESULTSより変 heterogeneous eNOS legacy 伝子の転WRITE はRPA を Introduction して suppress されていることがprove された.

项目成果

K. Kuwahara: "Neuron-Restrictive Silencer Element/Neuron-Restrictive Silencer Factor System Regulates Basal-and Endothelin-1-Inducible Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression in Ventricular Myocytes"Mol Cell Biol.. 21. 2085-2097 (2001)

K. Kuwahara：“神经元限制性沉默元件/神经元限制性沉默因子系统调节心室肌细胞中的基础和内皮素-1诱导的心房钠尿肽基因表达”Mol Cell Biol.. 21. 2085-2097 (2001)

Y.Mizuno: "Aldosterone Production is Activated in the Failing Ventricles in Humans."Circulation.. 103. 72-77 (2001)

Y.Mizuno：“醛固酮的产生在人类衰竭的心室中被激活。”循环.. 103. 72-77 (2001)

E.Ogawa: "Outside-in Signaling of Fibronectin Stimulates Cardiomyocyte Hypertrophy in Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes"J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)

E.Okawa：“纤连蛋白的由外向内信号刺激培养的新生大鼠心室肌细胞中的心肌细胞肥大”J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)

I.Hamanaka: "Induction of JAB/SOCS-1/SSI-1 and CIS3/SOCS-3/SSI-3 Is Involved in gp130 Resistance in Cardiovascular System in Rat Treated with Cardiotrophin-1 (CT-1) in vivo."Circ.Res.. (In press). (2001)

I.Hamanaka：“JAB/SOCS-1/SSI-1 和 CIS3/SOCS-3/SSI-3 的诱导参与体内用 Cardiotropin-1 (CT-1) 治疗的大鼠心血管系统中的 gp130 耐药性。”

K.Kuwahara: "Cardiotorphin-1 phosphorylates Akt and BAD, and prolongs cell survival via a PI3K-dependent pathway in cardiac myocytes."J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)

K.Kuwahara：“Cardiotorphin-1 磷酸化 Akt 和 BAD，并通过心肌细胞中的 PI3K 依赖性途径延长细胞存活时间。”J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)