バキュロウイルス多重感染系を用いた翻訳装置超高分子複合体の再構成

使用杆状病毒多重感染系统重建翻译装置超分子复合物

• 批准号: 11169243
• 负责人: 芝 清隆
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169243/
• 关键词: 翻訳; ヒト; アミノアシルtRNA合成酵素; 超高分子複合体; 付加ドメイン; バキュロウイルス; 共発現; 再構成系; 遺伝情報; タンパク質複合体; 大量発現; 組み換え

高等真核生物の細胞質では、8つのアミノアシルtRNA合成酵素と3つの非アミノアシルtRNA合成酵素タンパク質の、合成11のタンパク質が超高分子複合体を形成している。この複合体の構造及び機能を解析するために、多重感染が可能なバキュロウイルス発現系を利用した、ヒトアミノアシルtRNA合成酵素超高分子複合体の再構成系を確立した。ヒトのARS超高分子複合体を構成する8つのARS(IleRS,LeuRS,MetRS,AspRS,GluProRS,ArgRS,GlnRS,LysRS)と3つの非ARS因子(pro-EMAPII,JTV1,p18)、11の遺伝子の全長を、昆虫細胞内で強い転写活性をもつPolhプロモーター下にクローニングした組み換え体バキュロウイルスの作成をした。また、それぞれのARSがもつ、高等真核生物に特有の付加ドメインを欠失させた種々の変異組み換え体のシリーズも含め、合計29種の発現ベクターを作製した。また、IleRS、LysRS、ProRS、pro-EMAPII,JTV1,p18に対するポリクローナル抗体も作成し、免疫沈降実験での同定、その他の実験に利用できる環境を準備した。IleRSと10種のコンポーネントをそれぞれ共発現させて、相互作用する因子を捜したところ、LeuRSとGluProRSのみが相互作用した。また、これら3者の共発現は3者複合体を形成した。より詳細な解析から、IleRSとGluProRSは、それぞれC末と融合点の付加ドメインを用いて相互作用すること、IleRSとLeuRS、それぞれのC末付加ドメインを用いて相互作用すること、IleRSとLeuRSとの相互作用は観察されないことがわかった。複合体の形成には多細胞真核生物に特有の付加ドメインが大きな役割を果たしていることがわかった。

The formation of ultra-high molecular complexes in the cytoplasm of higher eukaryotes The structure and function of the complex were analyzed, and multiple infections were established. 8 ARS (IleRS, LeuRS, MetRS, AspRS, GluProRS, ArgRS, GlnRS, LysRS), 3 non-ARS factors (pro-EMAPII, JTV1, p18), 11 full-length genes, strong transcription activity in insect cells, and 3 non-ARS factors (pro-EMAPII, JTV1, p18). A total of 29 species were found in different groups of organisms, such as higher eukaryotes and higher eukaryotes IleRS, LysRS, ProRS, pro-EMAPII, JTV1, p18 are prepared for the preparation of antibodies, the synchronization of immunosedimentation, and the use of other technologies. IleRS and GluRS interact with each other. The formation of a three-part complex. IleRS and LeuRS interact with each other in detail. Complex formation is unique to multicellular eukaryotes.

项目成果

JE.Kim,K.Shiba, et al.: "Elongation factor-associating domain is inserted into human cysteinyl-tRNA synthetase by alternative splicing"Nucl.Acids Res.. 28. 2866-2872 (2000)

JE.Kim，K.Shiba 等人：“通过选择性剪接将延伸因子相关结构域插入人半胱氨酰-tRNA 合成酶中”Nucl.Acids Res.. 28. 2866-2872 (2000)

YM.Hou, K.Shiba et al.: "Conservation of a tRNA core for aminoacylation"Nucl. Acids Res.. 27(24). 4743-4750 (1999)

YM.Hou、K.Shiba 等人：“氨酰化的 tRNA 核心的保守性”Nucl。

SG.Park, K.Shiba et al.: "Precursor of pro-apoptotic cytokine modulates aminoacylation activity of tRNA synthetase"J. Biol. Chem.. 274(24). 16673-16676 (1999)

SG.Park, K.Shiba 等人：“促凋亡细胞因子的前体调节 tRNA 合成酶的氨酰化活性”J.

J-EA.Michaels, K.Shiba et al.: "Autonomous folding ora C-terminal inhibitory fragment of Escerichia coli isoleucine-tRNA synthetase"Biochimica Biophysica Acta. 1433. 103-109 (1999)

J-EA.Michaels、K.Shiba 等人：“大肠杆菌异亮氨酸-tRNA 合成酶的 C 末端抑制片段的自主折叠”Biochimica Biophysicala Acta。

SB.Rho, K.Shiba et al.: "Genetic dissection of protein-protein interactions in a multi-tRNA synthetase complex"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96(8). 4488-4493 (1999)

SB.Rho、K.Shiba 等人：“多 tRNA 合成酶复合物中蛋白质-蛋白质相互作用的基因解剖”Proc。