ヒトアミノアシルtRNA合成酵素活性の酵素間相互作用依存性

人氨酰-tRNA合成酶活性的酶-酶相互作用依赖性

基本信息

批准号：
12029222
负责人：
芝清隆
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトなどの高等真核生物では、アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)、翻訳開始因子、翻訳伸長因子などの翻訳に関わる装置が超高分子複合体を形成しており、微生物には観察されない特徴となっている。このような複合体を形成することにより、どのような新たな生物プログラムを獲得しているかを、ヒトのアミノアシルtRNA合成酵素複合体に焦点をあてて明らかにするのが研究の目的である。そのために、ヒトのARS超高分子複合体を構成する8つのARS(IleRS,LeuRS,MetRS,AspRS,GluProRS,ArgRS,GlnRS,LysRS)と3つの非ARS因子(pro-EMAPII,JTV1,p18)、11の遺伝子の全長を、昆虫細胞内で強い転写活性をもつPolhプロモーター下にクローニングした組み換え体バキュロウイルスの作成をした。また、それぞれのARSがもつ、高等真核生物に特有の付加ドメインを欠失させた種々の変異組み換え体のシリーズも作成した。合計29種のヒトARS発現ベクターを用いることにより、昆虫細胞を用いた共発現実験が可能となった。単独発現からは活性の観察されないMetRS活性に関して、いろいろな組み合わせの共発現からの活性の回復を調べてみたが、用いた条件ではやはり活性は観察されなかった。2コンポーネント以上の因子の相互作用がMetRSの活性には必要なのかもしれない。別の実験として、IleRS、LeuRS、GluProRSの3者の複合体形成機構について再構成実験から調べた。その結果、IleRSとGluProRSは、それぞれC末と融合点の付加ドメインを用いて相互作用すること、IleRSとLeuRS、それぞれのC末付加ドメインを用いて相互作用すること、IleRSとLeuRSとの相互作用は観察されないことがわかった。IleRS、LeuRS、GluProRSの3者共発現は3者複合体を形成することから、この複合体の形成にはLeuRSのC末付加ドメインが中心的な役割をもつことが明らかとなった。

在较高的真核生物（例如人类）中，参与翻译的设备，例如氨基酰基tRNA合酶（ARS），翻译起始因子和翻译伸长因子形成了超聚合物复合物，使其成为微生物中未观察到的特征。该研究的目的是阐明通过形成这种复合物，重点关注人类氨基酰基-TRNA合酶复合物来获得哪些新的生物学程序。 To this end, we created a recombinant baculovirus in which the entire length of the 8 ARSs (IleRS, LeuRS, MetRS, AspRS, GluProRS, ArgRS, GlnRS, LysRS) that constitute the human ARS ultrapolymer complex, three non-ARS factors (pro-EMAPII, JTV1, p18), and 11 genes were cloned into the Polh promoter, which has strong昆虫细胞内的转录活性。我们还创建了一系列不同的突变重组因素，每个ARS都删除了较高的真核生物独有的其他域。通过总共使用29个人类ARS表达载体，使用昆虫细胞的共表达实验是可能的。关于从唯一表达中观察到的Metrs活性，我们研究了从共表达的各种组合中恢复活性，但是在所使用条件下未观察到活性。对于Metrs活动，可能需要两个或多个组件的相互作用。在另一个实验中，我们研究了重建实验中三方，伊拉斯，leurs和gluprors之间复杂形成的机制。结果表明，iLers和glupror与C末端和融合点附加域相互作用，Ilers和Leurs与每个C末端附加域相互作用，并且观察到Ilers和Leurs之间的相互作用。由于iLers，Leurs和glupror的三方共表达形成三方复合物，因此已经揭示了Leurs的C末端附加域在该复合物的形成中起着核心作用。