マイクロ遺伝子重合法を用いた人工バイオシグナル分子創出系の確立

利用微基因聚合方法建立人工生物信号分子产生系统

• 批准号: 10878115
• 负责人: 芝 清隆
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878115/
• 关键词: 人工遺伝子; 人工タンパク質; マイクロ遺伝子; 分子進化工学; 材料工学; 生物素材; 細胞接着; バイオシグナル; 進化工学; 繰り返し構造; 新規活性物質; 試験管内進化; 生体高分子

既存の遺伝子に依存しないで、自由に機能性タンパク質を試験管の中で人工創出する実験系を開発している。2年間の本研究では特に、「新しいバイオシグナル分子としての人工タンパク質を自由に創り出す系を確立する」ことを目標として、11年度の研究では、(1)人工タンパク質を固定したニトロセルロース膜を用いた細胞接着スクリーニング系の確立、(2)ニトロセルロース膜を利用しない人工タンパク質の細胞接着活性測定系の構築、の2つを目標とした。(1)では、精製した人工タンパク質をニトロセルロース膜にスポット固定し、培養細胞(Sf-9)と、室温で2時間インキュベート後、洗浄し、細胞をアミドブラック染色することにより、細胞接着活性を示す人工タンパク質を選択することが可能となった。この手法を用いることにより、20種の人工タンパク質の中で、1種(#331)が細胞接着活性を持つことが明らかとなった。この#331人工タンパク質を用いることにより、アガロースビーズを利用した、細胞接着活性測定系をさらに構築した。これは、#331人工タンパク質のN末に存在するポリヒスチジントラクトを特異的に結合する、NTAアガロースビーズを利用することにより、アガロースビーズの表面に#331人工タンパク質をコートし、これを培養細胞(Sf-9)とインキュベートすることから、細胞をアガロースビーズの表面に吸着させる方法である。磁気金属の封入されたNTAアガローズビーズを利用することにより、迅速に非特異的結合細胞を洗浄できる系も構築することに成功した。これらの2つの技術を利用することから、今後、大規模な細胞接着活性を持つ新しいバイオシグナル分子としての人工タンパク質をスクリーニングすることが可能となった。

Existing の posthumous son 伝 に dependent し な い で, free に functional タ ン パ ク qualitative を test tube の で artificial hit す る be 験 started を 発 し て い る. 2 years の this study で は に, "new し い バ イ オ シ グ ナ ル molecular と し て の artificial タ ン パ ク qualitative を free に gen り を す system is to establish す る" こ と を target と し て, 11 の research で は, (1) artificial タ ン パ ク qualitative を fixed し た ニ ト ロ セ ル ロ ー を ス membrane with い た cells then ス ク リ ー ニ ン グ の establishment, (2) ニ ト ロ を セ ル ロ ー ス membrane using し な い artificial タ ン パ ク qualitative の cells then activity determination is の building, 2 つ の を target と し た. (1) で は, refined し た artificial タ ン パ ク qualitative を ニ ト ロ セ ル ロ ー ス membrane に ス ポ ッ ト fixed し, cultured cells (Sf - 9) と, 2 time at room temperature で イ ン キ ュ ベ ー ト incorporated, after し, cell を ア ミ ド ブ ラ ッ ク dyeing す る こ と に よ り activity, cell then を す in artificial タ ン パ ク qualitative を sentaku す る こ と が may と な っ た. こ の gimmick を with い る こ と に よ り, 20 の artificial タ ン パ ク qualitative の で, 1 kind of activity then cells (# 331) が を hold つ こ と が Ming ら か と な っ た. こ の # 331 artificial タ ン パ ク qualitative を with い る こ と に よ り, ア ガ ロ ー ス ビ ー ズ を using し た, cell and activity determination を さ ら に build し た. こ れ は, # 331 artificial タ ン パ ク qualitative の に exist at the end of the N す る ポ リ ヒ ス チ ジ ン ト ラ ク ト を specific に combining す る, NTA ア ガ ロ ー ス ビ ー ズ を using す る こ と に よ り, ア ガ ロ ー ス ビ ー ズ の surface に # 331 artificial タ ン パ ク qualitative を コ ー ト し, こ れ を cultured cells (Sf - 9) と イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と Youdaoplaceholder5 ら, the cell をアガロ スビ スビ ズ ズ ズ the surface of the ズ に adheres to the させる method である. Magnetic 気 metal sealed の さ れ た NTA ア ガ ロ ー ズ ビ ー ズ を using す る こ と に よ り, rapid に incorporated the combination of nonspecific cellular を で き る department も build す る こ と に successful し た. こ れ ら の 2 つ の technology を use す る こ と か ら activity and then, in the future, large-scale な cells を hold つ new し い バ イ オ シ グ ナ ル molecular と し て の artificial タ ン パ ク qualitative を ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と が may と な っ た.

项目成果

K.Shiba: "In vitro constructive approaches to the origin of coding sequences" J.Biochem.&Mol.Biol.31. 209-220 (1998)

K.Shiba：“编码序列起源的体外构建方法”J.Biochem。

芝 清隆: "アミノアシルtRNA合成酵素から見たゲノム形成のダイナミクス" 細胞工学. 17. 771-780 (1998)

Kiyotaka Shiba：“从氨酰-tRNA合成酶的角度来看基因组形成的动力学”《细胞工程》17. 771-780 (1998)。

JW Chihade, K.Shiba et al.: "Strong selective pressure to use G : U to mark an RNA acceptor stem for alanine" Biochemistry. 37. 9193-9202 (1998)

JW Chihade、K.Shiba 等人：“使用 G : U 来标记丙氨酸 RNA 受体茎的强选择压力”生物化学。

SB.Rho, K.Shiba et al.: "Genetic dissection of protein-protein interactions in a multi-tRNA synthetase complex"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96(8). 4488-4493 (1999)

SB.Rho、K.Shiba 等人：“多 tRNA 合成酶复合物中蛋白质-蛋白质相互作用的基因解剖”Proc。