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ショウジョウバエ培養細胞を用いた再構築概日系の確立

利用培养果蝇细胞重建昼夜节律系统的建立

基本信息

批准号：
11874123
负责人：
松本顕
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11874123/
关键词：
ショウジョウバエサーカディアンリズム培養細胞

项目摘要

per,timに対する正の転写因子であるCLKを強力な定常的発現プロモーターであるcytoplasmic actinプロモーターを使って(Act5C-clk)培養細胞内で発現させた。western blotによりPERおよびTIMの発現をモニターすると、TIMの発現は誘導されるが、PERの発現は誘導されなかった。そこで、Act5C-clkとともにper遺伝子のゲノム断片(G-per)をS2 cellにco-transfectした。その結果、TIMのみでなくPERの発現も観察された。次に28時間に渡って、TIMおよびPERの発現量の変動のモニターを試みたが、変動は観察されなかった。これは、正の転写因子であるCLKが恒常的に供給された結果であると解釈された。そこで、一過的な発現を誘導するheat shock protein 70のプロモーター下流にclk遺伝子を連結し(hs-clk)、37℃30分の熱ショックにより一過的にCLKを発現させて、その後のPERおよびTIMの発現をモニターした。hs-clkとG-perのco-transfectionを行うと、熱ショックを与えた場合にのみPERの強い発現が誘導された。熱ショックを与えた後、約5日間に渡って3-4時間ごとのサンプリングを行い、PERおよびTIMの発現量の変動のモニターを試みると、約26時間の周期性を持ったPER/TIM量の変動が観察された。振動は約4回繰り返された。再現性を確認するために、実験を繰り返した。実験毎に、周期、およびPER量のピーク位相にはズレが生ずるが、振動がほぼ一定周期で繰り返されること、数日後にはPER/TIMの発現が観察できないレベルにまで減衰することには再現性があり、培養細胞内での概日リズムの再構築に成功したと判断した。

Per,tim, the positive transcription factor CLK strongly and constantly produces cytoplasmic actin in cultured cells (Act5C-clk). Western blot: PER and TIM occurrence are induced. Act5C-clk-to-per-cell co-transfect The results, TIM and PER were observed. The next 28 hours, the TIM and PER appear to be moving, moving. This is the result of a constant supply of CLK. The heat shock protein 70 is induced by the heat shock protein 70, and the heat shock protein 70 is induced by the heat shock protein 70. The heat shock protein 70 is induced by the heat shock protein 70. hs-clk and G-per co-transfection are induced by the strong presence of PER in hot and cold situations. After the heat treatment, about 5 days, 3-4 hours, the change of PER/TIM is observed. Vibrating about 4 times. Reproducibility is confirmed. Every cycle, period, PER quantity, phase, period, period.